쥐의 뇌에서 신경혈관 단위를 분리하는 방법

초록

출처: Brzica, H., et al,. 갓 분리된 쥐 뇌 미세혈관에서 막 샘플을 준비하는 간단하고 재현 가능한 방법입니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 안락사된 쥐로부터 뇌 미세혈관을 분리하는 과정을 보여줍니다. 여기에는 뇌 해부, 조직 세척, 기계적 소화, 그리고 미세혈관의 순수한 분획을 분리하기 위한 반복적인 원심분리가 포함됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다. 프로토콜의 절차적 흐름은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 프로시저 설정

1. 뇌 미세혈관 완충액(BMB)을 준비합니다. 54.66g의 D-만니톨, 1.90g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸레테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산), 1.46g의 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(즉, 트리스) 염기의 무게를 깨끗한 비커에 넣습니다. 탈이온수 1.0L를 넣으십시오. 자석 교반기를 사용하여 BMB 버퍼의 성분을 혼합합니다. 용액이 완전히 혼합되면 1.0M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
2. 동물을 마취하기 전에 26% 덱스트란(MW 75,000) 용액(w/v)을 준비합니다. 다음 단계에 따라 dextran 솔루션을 준비합니다.
   메모: dextran이 수성 완충액에 용해되는 데 약 1.5-2시간이 걸릴 수 있으므로 이 용액을 미리 준비하는 것이 매우 중요합니다.
   1. 분말 덱스트란(100mL 완충액당 26g)의 무게를 달아 깨끗한 비커에 넣습니다.
   2. 적절한 부피의 BMB를 측정하고 별도의 깨끗한 비커에 분배합니다.
   3. 분말 덱스트란이 들어 있는 비커에 BMB를 천천히 붓습니다. BMB를 붓는 동안 유리 교반 막대를 사용하여 분말 덱스트란을 수동으로 혼합합니다.
   4. 사용 직전에 1.0M HCl로 pH를 7.4로 조정하십시오.
      메모: 12마리의 Sprague-Dawley 쥐(수컷 또는 암컷, 생후 3개월, 각각 200-250g)의 뇌 미세혈관을 일반적으로 분리하려면 200mL의 덱스트란 용액(즉, 200mL의 BMB에 52g의 덱스트란)이 필요합니다.

2. Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 조직 추출

1. 원하는 실험적 치료 후 케타민(50mg/kg, 2.5mL/kg i.p.) 및 자일라진(10mg/mL, 2.5mL/kg I,p.)을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐를 마취합니다. 케타민과 자일라진을 0.9% 식염수에 각각 20mg/mL 및 4.0mg/mL의 최종 농도로 희석합니다. IACUC (Institutional Animal Care & Use Committee) 지침에 따라 날카로운 단두대를 사용하여 동물을 참수하여 안락사시킵니다. 수컷 및 암컷 Sprague-Dawley 쥐 모두에 대해 동일한 절차를 사용하십시오.
2. 수술용 가위를 사용하여 한 번 가로로 절단하여 쥐 두개골의 피부를 절제합니다.
3. 롱거를 사용하여 조심스럽게 두개골 플레이트를 제거하고 뇌를 노출시킵니다.
4. 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 대뇌를 분리하고 분리된 뇌 조직을 5mL의 BMB가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 사용 직전에 BMB 완충액 1.0mL당 프로테아제 억제제 칵테일 1.0μL를 추가합니다.

3. 뇌 처리

1. 50mL 원뿔형 튜브의 뇌 조직을 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다.
2. 겸자를 사용하여 직경 12.5cm의 여과지에 뇌를 부드럽게 굴려 대뇌 피질에 느슨하게 붙어있는 외부 수막을 제거합니다. 뇌 조직을 여과지에 부드럽게 누르고 조직을 다시 굴립니다. 이 단계에서 여과지를 자주 뒤집습니다.
3. forceps.
   를 사용하여 맥락막신경총과 대뇌 반구를 분리합니다. 메모: 맥락막신경총(choroid plexus)은 대뇌실 표면에 국한된 투명한 막질 조직으로 나타납니다.
4. 뇌 조직을 부드럽게 평평하게 펴고 집게를 사용하여 남아 있는 수막과 후각구를 제거합니다.
5. 피질의 뇌 조직을 차가운 유리 절구에 넣습니다. 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 BMB 5.0mL를 모르타르에 첨가합니다.
6. 오버헤드 파워 균질기를 사용하여 3,700rpm에서 15번의 상하 스트로크를 사용하여 뇌 조직을 균질화합니다. 10mL 모르타르와 유봉 조직 분쇄기를 사용하여 균질화를 수행합니다. 각 개별 샘플의 균질화 사이에 70% 에탄올을 사용하여 유봉을 세척합니다.
   메모: 균질화 스트로크는 속도와 크기 측면에서 일관되어야 합니다.
7. 라벨이 부착된 원심분리기 튜브에 균질액을 붓습니다.

4. 원심분리 단계

1. 뇌 균질산염이 함유된 각 라벨링된 원심분리기 튜브에 26% 덱스트란 용액 8.0mL를 추가합니다.
2. 튜브를 두 번 뒤집은 다음 샘플을 완전히 와류로 만듭니다. 뇌 균질화 용액과 26% 덱스트란 용액의 철저한 혼합을 보장하기 위해 여러 각도를 사용하여 각 샘플의 볼텍싱을 수행합니다.
3. 4°C에서 15분 동안 5,000 x g의 원심분리기 샘플.
   메모: 일부 분석의 경우 뇌 미세혈관과 뇌 실질을 비교하는 것이 유용합니다. 뇌 실질에서 단백질 발현의 평가가 필요한 경우, 이 원심분리 단계의 상등액(즉, 뇌 실질 분획)을 수집하여 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 진공 흡입기와 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
   메모: 펠릿을 방해하지 않도록 주의해야 합니다. 그렇지 않으면 수집된 뇌 미세혈관의 양이 줄어들어 이 절차로 인한 단백질 수율이 크게 감소합니다.
5. 펠릿을 BMB 함유 프로테아제 억제제 칵테일 5.0mL(즉, BMB 완충액 1.0mL당 1.0μL 프로테아제 억제제 칵테일)에 재현탁합니다. 철저한 혼합을 보장하기 위해 펠릿을 소용돌이
치십시오.
6. 이 프로토콜의 4.1-4.2단계에 설명된 대로 각 원심분리기 튜브 및 와류에 8.0mL의 26% 덱스트란을 추가합니다.
7. 5,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기 시료 주입.
8. 진공 플라스크와 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡입하고 뇌 미세혈관이 포함된 펠릿이 파괴되지 않았는지 확인합니다.
   메모: 튜브 벽에 부착된 과도한 재료에는 미세 혈관이 포함되어 있지 않으므로 조심스럽게 세척하고 제거해야 합니다.
9. 4.5단계부터 4.8단계까지 두 번 더 반복합니다.
10. 4번의 덱스트란 원심분리 단계가 완료되면 각 펠릿과 와류에 5.0mL의 BMB를 추가하여 샘플을 재현탁합니다.
    메모: 단계 4.10이 완료되면 단백질 국소화 분석을 위해 전체 미세혈관을 수집할 수 있습니다. 이는 다시 현탁된 마이크로혈관 펠릿의 50μL 분취액을 유리 현미경 슬라이드에 바르면 달성할 수 있습니다. 그런 다음 마이크로 용기를 가열 블록에서 95°C에서 10분 동안 가열한 다음 얼음처럼 차가운 에탄올에 추가로 10분 동안 고정합니다. 그런 다음 이미징 연구에 필요할 때까지 슬라이드를 4°C에서 보관할 수 있습니다.

결과

그림 1 : 쥐의 뇌 미세혈관을 분리하고 막 샘플을 준비하기 위한 절차 및 프로토콜의 개요

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	#P8340	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
D-만니톨	시그마-알드리치	#M4125	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
에그타	시그마-알드리치	#E3889	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
트리즈마 베이스	시그마-알드리치	#T1503	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
덱스트란 (MW 75,000)	스펙트럼 화학 Mftg Corp	#DE125	뇌 실질에서 미세혈관을 분리하기 위해 원심분리 단계에서 사용되는 덱스트란
제타민	MWI 동물 건강	#501072	전신 마취제
자일라진	서양 의료 공급	#의 5530	전신 마취제
0.9% 식염수	서양 의료 공급	해당 사항 없음	전신 마취 희석제
여과지(직경 12.5cm)	폭스바겐	#의 28320-100	뇌 조직에서 수막을 제거하는 데 사용됩니다
원심분리기 튜브	사르슈테트	#60.540.386	dextran 원심분리 단계에 사용되는 일회용 튜브
Pierce™ Coomassie Plus(Bradford) 분석	써모피셔 사이언티픽	#의 23236	멤브레인 제제의 단백질 농도 측정
Wheaton 오버헤드 전력 균질화기	DWK 생명과학	#903475	샘플의 균질화에 필요
10.0ml 유리 모르타르 및 유봉 티슈 그라인더	DWK 생명과학	#358039	샘플의 균질화에 필요
염산	시그마-알드리치	#H1758	완충액의 pH 조정에 필요
표준 겸자	정밀 과학 도구	#의 91100-12	뇌 조직의 해부를 위해 사용하는
프리드먼-피어슨 롱거스	정밀 과학 도구	#의 16020-14	뇌를 분리하기 위해 두개골을 여는 데 사용됩니다.
50ml 원추형 원심분리기 튜브	써모피셔 사이언티픽	#352070	분리 후 뇌 조직 수집에 사용
유리 파스퇴르 피펫	써모피셔 사이언티픽	#의 13-678-20C	dextran 스핀에 따른 세포 파편의 흡인에 사용됩니다.
에탄올, 무수	시그마-알드리치	#459836	티슈 그라인더 청소에 사용되며 증류수로 70%로 희석합니다.
케타민
얼음 양동이

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