인간 신경 줄기 세포에서 피질 피라미드 뉴런 생성

초록

출처: Gouder, L., et al,. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 신경 줄기 세포의 접착력과 성장을 향상시키기 위해 폴리오르니틴과 라미닌으로 코팅된 유리 커버슬립을 제조하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 순차적인 배양 및 세척을 포함하며, 뉴런에서 발견되는 구조를 모방하여 뉴런 세포 성장 및 분화를 촉진하는 지지 매트릭스의 형성을 촉진합니다.

프로토콜

1. 신경 세포 배양
   메모: 만능 줄기세포의 섬유아세포 재프로그래밍, 등쪽 텔렌스팔론 계통에 대한 헌신, 후기 피질 전구세포(LCP)의 유도체, 증폭 및 뱅킹이 Boissart 등에서 설명되었습니다. LCP 유사 세포의 신경 분화도 Boissart 등에 따르면 약간의 변형으로 수행되었습니다. 섬유아세포를 유도만능줄기세포로 직접 재프로그래밍한 다음 뉴런으로 분화시키는 다른 절차가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 피라미드 글루타메이터 뉴런의 선택적 생산을 허용하기 때문에 유지되었습니다.
   1. 6웰 배양 플레이트를 유리 커버슬립으로 폴리오르니틴(DPBS(Dulbecco s Phosphate Buffered Saline)의 1/6로 희석, 스톡 농도 0.01%) O/N으로 처리한 다음 DPBS를 3회 세척합니다. 그런 다음 플로우 후드 아래에서 최소 10시간 동안 라미닌(스톡 농도 1mg/ml, DPBS로 500배 희석)을 추가합니다.
   2. DMEM(Dulbecco의 Modified Eagle's Medium)/F12(500ml), N2 보충제 2바이알(각 5ml), B27 보충제 바이알 2개(각 10ml), Pen-Streptomycin 10ml(페니실린 = 10,000 단위/ml 및 스트렙토마이신 = 10,000 units/ml)로 구성된 배양 배지 3ml에 유리 커버슬립이 있는 6웰 배양 플레이트에서 저밀도(50,000 cells/cm²)로 NSC 플레이트 및 디스패치 NSC, 성장 인자가없는 2- 메르 캅토 에탄올 1ml (원액 : 50mM) 및 라미닌 (1/500). 중요한 단계: 세포 클러스터링을 줄이기 위해 회전 움직임이 느린 세포를 추가하여 이 단계를 신중하게 수행합니다.
   3. 배양 배지를 제거합니다. 2 μg/ml의 새로운 라미닌 용액이 함유된 새로운 N2B27 배지를 추가하여 뉴런이 유리 커버슬립에 부착된 상태를 유지하고 응집되지 않도록 합니다. 3일마다 매체를 교체하십시오. 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 새 배지를 추가하기 전에 나머지 배지(200μl)의 일부를 유지하십시오. 또는 빠르게 진행하여 총 부피(3ml)를 변경합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PD-PBS (1X), 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드	Gibco/ 생명 기술	14190169
Poly-L-Ornithine 용액 생물 시약	시그마 알드리치	P4957
마우스 라미닌	더처 도미니크	354232
N2 보충제	Gibco/ 생명 기술	17502048
B-27 보충제 (비타민 A 제외) (50X)	Gibco/ 생명 기술	12587010
DMEM/너트. F-12 W/GLUT-I 믹스	Gibco/ 생명 기술	31331028
뉴로베이스살 메드 SFM	Gibco/ 생명 기술	21103049
2-메르캅토에탄올	Gibco/ 생명 기술	우편번호 31350-010
펜 Steptomycin	Gibco/ 생명 기술	15140-122
커버 글라스 13mm	폭스바겐	Tel.: 631-0150
Prolong Gold Antifade 시약 avec DAPI	Gibco/ 생명 기술	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, 점성 액체	시그마 알드리치 치미	P7949
인간 섬유아세포	Coriell 세포주 생물저장소	GM 4603 및 GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, 미국 뉴저지주 캠든
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