Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

초록

출처: Slater, B. J., et al., Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 쥐 새끼의 뇌에서 콜리큘로-시상 피질 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 고립된 뇌는 표시된 슬라이드에 정렬되고 청각 중뇌와 전뇌를 같은 평면에 정렬하기 위해 비스듬히 절단됩니다. 그런 다음 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조를 포함하는 절편을 보존을 위해 보관실로 옮깁니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 슬라이싱을 위한 마우스의 뇌 준비 및 제거

1. 관류 및 슬라이스 배양을 준비합니다.
   1. 슬라이스하기 약 30분 전에 기록 또는 이미징 전에 슬라이스 배양을 위해 고자당 절단 용액과 저칼슘 인공 뇌척수액(aCSF)을 준비합니다.
   2. 관류 및 슬라이싱을 위해 필요한 모든 도구 (큰 뭉툭한 끝 가위, 작은 스프링 가위, 해부학 집게, 큰 가위 또는 단두대, 홍채 가위, 보석상 집게, 27G x 1/2 인치 바늘이있는 10ml 주사기, 1cm x 2cm 여과지의 작은 조각, 슬라이스 전달을위한 깨진 파스퇴르 피펫) 관류 및 슬라이스를 위해 그리고 관류 트레이를 준비합니다.
   3. 32^°C 수조에 산소가 공급된 aCSF가 있는 인큐베이팅 챔버를 설치하고 절단 용액으로 채워진 배양 접시를 설치합니다.
2. 슬라이싱을 위한 절단 단계를 준비합니다.
   1. 3% 한천의 작은 조각을 약 1cm³개로 잘라 뇌의 백스톱으로 사용하고 1.5cm x 1.5mm x 3mm를 하구(IC)를 지지하는 데 사용할 돌기로 자릅니다.
   2. 백스톱을 시아노아크릴레이트 접착제로 스테이지에 붙이고 백스톱 오른쪽에 있는 범프를^80o 각도를 형성하도록 합니다.
3. 뇌를 제거하십시오.
   1. 케타민 100mg/kg 및 자일락신 3mg/kg(또는 이에 상응하는 윤리 위원회 승인 절차)으로 산후 12일-출생 후 20일(P12-P20, 이상적으로는 P14-18) 마우스를 심층 마취합니다.
      메모: 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 통해 적절한 마취 수준을 확인합니다. 동물이 잠시 마취를 하기 때문에 안과 연고는 필요하지 않습니다.
   2. 뭉툭한 끝 가위를 사용하여 xiphoid 과정의 흉곽을 목에 노출시킵니다.
      1. xiphoid 프로세스를 찾아 약 1.5cm의 수평 절단을 만듭니다.
      2. 이전 수평 절단의 끝에서 어깨까지 각각 약 1.5cm씩 두 개의 수직 절단을 만듭니다.
   3. 횡격막과 늑연골 접합부를 절단하여 심장을 노출시킵니다.
   4. 작은 스프링 가위를 사용하여 심장의 복부에서 등쪽까지 오른쪽 심방을 2-5mm로 작게 자릅니다.
   5. 27G x 1/2 인치 바늘이 달린 10ml 주사기를 사용하여 좌심실을 주입하고 고 자당 절단 용액으로 동물을 빠르게 관류합니다.
   6. 피가 맑아지면 더 큰 가위를 사용하여 머리를 제거합니다.
      메모: 우리는 관류의 효용성을 체계적으로 평가하지 않았습니다. 그러나 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 어린 쥐의 경심 관류는 거의 100% 성공할 수 있으며 형광을 발하고 이미징을 방해할 수 있는 적혈구를 제거하는 이점이 있습니다.
   7. 두개골을 드러내기 위해 정중선 아래로 피부를 자릅니다.
   8. 구부러진 홍채 가위를 사용하여 눈 사이의 두개골을 자른 다음 눈 사이의 절개부터 시작하여 아래의 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 정중선 봉합사를 따라 앞쪽에서 뒤쪽으로 조심스럽게 자릅니다.
      메모: 경막은 보통 두개골과 함께 떨어져 나갑니다. 필요한 경우 뇌를 조심스럽게 제거하기 전에 경막을 제거하십시오.
   9. 보석상 겸자를 사용하여 두개골을 들어 올리고 조심스럽게 뇌를 제거한 다음 뇌를 절단 용액에 넣습니다. 피질이 손상되지 않도록 주의한다.

2. 슬라이싱을 위한 뇌 준비

1. 비브라톰 스테이지에 장착하기 위한 두뇌 준비.
   1. 90^o에 두 선, 왼쪽 상단에서 오른쪽 아래로 17^o에 대각선으로 표시된 슬라이드를 사용하여 두 선이 만나는 곳에서 교차하여 면도날을 사용하여 뇌 등쪽을 위로 향하게 놓고 뇌 끝 뇌의 2-4mm를 제거하여 평평한 표면을 만듭니다.
   2. 새로 생성된 평평한 표면에 뇌의 꼬리 쪽을 위로 향하게 놓고 뇌의 등쪽 표면을 수평선에 맞추고 뇌의 정중선을 수직선에 맞춥니다.
   3. 면도날을 17^o 라인에 맞추고 면도기를 30^o 각도로 기울이고 이중 대각선 절단으로 오른쪽 피질의 약 3mm를 제거합니다 (수평면에서 17^o, 관상동맥에서 60^o).
2. 비브라톰 무대에 두뇌를 장착합니다.
   1. 1cm x 2cm의 작은 여과지를 뇌의 복부 쪽에 놓고 긴 치수가 정중선에 수직이되도록합니다.
   2. 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 백스톱 앞부분(및 범프 왼쪽)에 조심스럽게 바릅니다.
   3. 이중 대각선으로 절단된 뇌 면을 접착제에 올려 뇌의 꼬리 부분과 뒷뇌가 돌기 위에 받쳐지고 뇌의 오른쪽이 백스톱에 닿도록 합니다.
   4. 뇌를 섬세하게 눌러 전체 표면이 슬라이싱 챔버와 접촉하도록 합니다.

3. Colliculo-thalamocortical Slice 얻기

1. 빠르게 절단 단계를 가져 와서 진동에 놓고 절단 솔루션으로 무대를 채 웁니다.
2. 블레이드를 뇌의 상단(복부 쪽)에 맞춥니다.
3. 뇌 상단에서 1-1.5mm를 제거하고 300-500μm 슬라이스를 제거한 다음 제거 후 깊이를 평가합니다.
   참고: IC, 내측 외상핵(MGB) 및 외측 외상핵(LGN)이 모두 보이고 치상회가 'C'자 모양을 형성할 때 600μm 슬라이스 1-2개를 취합니다. 그림 1A를 참조하십시오.
4. 가열된(32 ^oC) 보관실에 슬라이스를 놓습니다.

결과

그림 1. colliculo-thalamocortical brain slice의 Flavoprotein 자가형광 영상.(A) 플라보단백질 자가형광에 의해 확인된 연결된 colliculo-thalamocortical brain slice. 0.05Hz에서 전기 자극을 4Hz에서 이미지화하고 푸리에 처리하여 자극 주파수에서 전력을 표시합니다. MGB, 시상 망상핵(TRN) 및 청각 피질(AC) 및 말량 선조체(CS)의 활성화에 유의하십시오.(B) 연결되지 않은 절편. MGB의 활성화만으로 IC의 전기 자극. 전체 경로는 17^o 각도가 약간 너무 가파르기 때문일 수 있습니다. (C) AC의 비정형 활성화. MG...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고자당 절단 용액			mM : 206 자당, 10.0 MgCl2, 11.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
저칼슘 aCSF			mM 내: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF를 참조하십시오.			mM 단위: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
디엠소	생명 기술	D12345	로트: 1572C502
큰 문화 접시	피셔브랜드	08-757-13	100x15mm 배양 접시
작은 배양 접시	송골매	353001	35x10mm 배양 접시
융기된 배양막	밀리셀	PICMORG50	슬라이스의 양쪽에서 산소가 함유된 유체 관류를 유지하는 데 사용됩니다.
뇌를 막는 한천			물에 3 중량%