In Vitro Induction of Neuromuscular Junctions from Engineered Human-Induced Pluripotent Stem Cells

초록

출처:Lin, C. et al., 인간 유도 만능 줄기 세포에서 유도된 체외 신경근 접합부. J. Vis. 특급.(2020).

이 실험은 인간이 유도한 만능 줄기 세포에서 신경근 접합부를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그것은 단계적 분화 과정을 사용하여 근관과 운동 뉴런 발달 및 시냅스 형성을 촉진하여 기능적 신경근 접합을 생성합니다.

프로토콜

1. 세포외 기질(ECM) 코팅 플레이트의 준비

1. ECM(재료 표 참조)을 얼음처럼 차가운 1x PBS로 최종 농도 2%로 희석합니다
.
2. 50mL 플라스틱 튜브에 1x PBS 49mL에 ECM 1mL를 추가합니다. 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
3. 1웰 플레이트의 각 웰에 6개의 커버슬립을 놓습니다. 각 웰에 1.5mL의 2% ECM을 추가합니다.
4. 웰 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 2% ECM으로 배양합니다.
5. 웰 플레이트에서 ECM을 흡입하고 사용하기 전에 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.

2. NMJ에 대한 iPSC의 차별화

1. 섹션 1에서 준비된 6웰 플레이트에 웰당 4 x 10⁵의 iPSC를 시드합니다. well.
   에 미리 보관된 커버슬립에 세포를 파종해야 합니다. 메모: 본 연구에서는 201B7^MYOD iPS 세포주를 사용하였다.
   1. 6cm 배양 접시의 iPSC에서 배지를 제거하고 1x PBS로 iPSC를 한 번 세척합니다.
   2. 접시에 세포 박리 용액 1mL를 넣고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   3. 접시에 3mL의 영장류 배아 줄기(ES) 세포 배지를 넣고 부드럽게 3회 피펫팅합니다.
   4. 분리된 iPSC가 포함된 상층액을 50mL 플라스틱 튜브에 넣고 4°C에서 160 x g으로 5분 동안 원심분리합니다.
   5. 상층액을 조심스럽게 흡인하고, 10μM Y27632로 3mL 영장류 ES 세포 배지에 iPSC를 재현탁한 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 계수합니다.
   6. 영장류 ES 세포 배지 및 10μM Y27632로 iPSC를 2 x 10⁵ cells/mL의 농도로 희석합니다. 섹션 1에 설명된 웰에 미리 증착된 커버슬립에 2mL의 iPSC를 추가합니다.

3. NMJ로의 iPSC 유도

1. 1일차, 6-well 플레이트에 iPSC를 파종한 후 24시간 후에 배양 배지를 제거하고 각 웰에 1μg/mL 독시사이클린을 함유한 2mL의 새로운 영장류 ES 세포 배지로 교체합니다.
2. 1μg/mL 독시사이클린(최종 농도)을 함유한 2mL의 근육 분화 배지(MDM)(표 1)로 배지를 각 웰에 변경합니다. 2일차부터 10일차까지 매일 매체를 새로 고칩니다.
3. 11일째부터 각 웰에 대해 배지를 2mL의 NMJ 배지(표 1)로 전환합니다. 이후 30일까지 3-24일마다 매체를 새로 고칩니다.
4. 30일째에 위상 반전 현미경으로 분화된 NMJ를 관찰합니다. NMJ는 하기 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

결과

표 1: 매체의 공식.

근육 분화 배지(MDM)	MEM 알파	500mL
	100mM 2-ME	1117μL의
	독시사이클린	1μg/mL
	한국증권거래소(KSR)	56mL(최종에서 10%)
	펜/연쇄상구균	2.5mL

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
배지, 성장 인자 및 시약
2-메르캅토에탄올	나칼라이 테스크	21418-42
B27, 깁코	지브코	제12587-001
증권 시세	R&D 시스템	248-BD
세포 분리 솔루션, Accumax	스템셀 테크놀로지스	#07921
임계점 건조기	히타치	ES-2030
독시사이클린	다카라	631311
ECM, Matrigel (성장 인자 감소)	코 닝	제356230
지그엔프	R&D 시스템	212-GD
겔화, IP 겔	제노 스태프	PG20-1
이온 코터	일본 전자(JEOL)	JEC3000FC
iPSC 배지, mTeSR	스템셀 테크놀로지스	85850
넉아웃 SR (KSR)	지브코	제10828-028
라이브 셀 현미경 검사	니콘		Eclipse Ti 현미경
MEM 알파	지브코	제12571-071
N2, 깁코	지브코	제17502-048
Neurobasal 배지	지브코	제21103-049
NT3	R&D 시스템	제267-N3
영장류 ES 세포 배지	프로셀	RCHEMD001
세엠	히타치	에스-4700
템	히타치	H7650
Y27632	와코 화학 GmbH	Tel.: 253-00513

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