검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 실험적 설정
- 조직 및 세포 수확을 시작하기 전에 모든 도구가 멸균 상태인지 확인하십시오. 필요한 경우 날카로운 수술용 가위, 매우 미세한 집게 한 쌍, 미세한 표준 집게 한 쌍을 고압멸균합니다. 또한 적절한 경우 UV 살균, 에탄올 노출 또는 증기 살균을 사용하여 세포 파종 전에 각 기질을 살균합니다.
- 뉴런 수확 및 해리를 위한 배지 및 재고 용액 준비
- Ham의 F12 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS) 및 1% N2 보충제를 첨가하여 Bottenstein and Sato's (BS) 배지를 준비합니다. 필요한 최종 부피를 웰당 500μl로 계산합니다(24웰 플레이트를 사용하는 경우).
- Ham의 F12 배지에 콜라겐 분해 효소 IV 스톡을 1.25 % wt / v의 농도로 준비합니다. 용액을 필터 멸균하고 -20 ° C에서 200 μl 분취액으로 보관합니다.
- Ham의 F12 배지에 2.5% wt/v의 농도로 소 췌장 트립신 스톡을 준비하고 필터 멸균 및 -20°C에서 200μl 분취액으로 보관합니다.
- F12 배지에 필터 멸균된 1mg/ml 지방산 무함유 소 혈청 알부민(BSA) 용액에 5μg/mL 농도의 신경 성장 인자(NGF) 스톡 용액을 준비하고 -20°C에서 200μl 분취액으로 보관합니다. 재구성 후 NGF를 필터링하지 마십시오.
- 표면 변형이 수행되지 않은 경우, 폴리-D-라이신(실온[RT]에서 15분 동안 0.1mg/ml) 및/또는 라미닌(37°C에서 2시간 동안 2-10μg/cm2)으로 커버슬립/플레이트를 코팅하여 뉴런 부착 및 신경돌기 성장을 적절하게 지원합니다.
- 사용하기 전에 항상 37°C의 수조에서 미디어를 예열하십시오.
2. 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 수확 및 해리
- 경추 탈구와 참수로 쥐를 제거합니다. 쥐를 면도하고 피부를 들어 올려 척추를 드러냅니다. 날카로운 가위를 사용하여 척추를 절제하고 제한된 장기와 혈관을 특별히 관리하십시오. 페트리 접시를 사용하여 척추를 생물 안전 캐비닛(클래스 II)으로 옮기고 등쪽 부분을 제거합니다.
- 멸균 및 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 세로축을 따라 척추를 반으로 나누어 탯줄 조직을 노출시킵니다. 이 시점에서는 척추를 흉곽 높이보다 낮은 두 개의 작은 부분으로 절단하여 DRG 뉴런 채취 중에 더 쉽게 처리할 수 있도록 하는 것이 도움이 됩니다. 가는 집게를 사용하여 DRG 뿌리를 당기거나 제거하지 않도록 주의하면서 모든 탯줄 조직을 부드럽게 제거합니다. 이런 식으로 DRG와 뿌리는 여전히 기둥에 싸여 있는 척추관 내에 노출됩니다. DRG가 운하에서 직접 나오는 흰색 필라멘트로 관찰하십시오.
- 매우 미세한 집게를 사용하여 척추관 깊숙이 들어가 신경절의 뿌리가 손상되지 않도록 주의하여 척추관에서 DRG 뿌리(DRG뿐만 아니라) 전체를 뽑아냅니다. DRG를 1% PS가 보충된 Ham's F12 배지 3-4ml가 들어 있는 작은 페트리 접시(60mm2)로 옮깁니다. 다른 동물을 사용하는 경우 별도의 접시를 사용하십시오.
- 해부 현미경으로 신경절 주변의 과도한 신경근을 DRG에서 멸균 집게와 메스를 사용하여 신경교세포 오염을 줄입니다. DRG를 35ml의 신선한 F12 배지와 함께 작은 페트리 접시(2mm)에 넣습니다.
- 200μl의 1.25% wt/v 콜라겐분해효소 IV형 원액(최종 농도 0.125%)을 추가하고 DRG를 37°C, 5% CO2에서 1시간 동안 배양합니다.유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하고 DRG를 흡인하거나 손상시키지 않도록 주의합니다. 0.125% wt/v 콜라겐분해효소 IV형 효소가 보충된 새로운 F12 배지를 추가하고 앞서 설명한 대로 1시간 동안 배양합니다.
- 매체를 흡입하고 F12 매체로 DRG를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 1.8ml의 F12 배지와 200μl의 트립신(최종 농도 0.25% wt/v)을 넣고 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 배양합니다.
- 트립신을 제거하고 효소 반응을 막기 위해 500μl의 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 F12 배지 1ml를 추가합니다. 배지를 흡입하고 DRG를 F12 배지로 3회 부드럽게 세척하여 혈청의 흔적을 제거합니다.
- 새 F12 배지 2ml를 넣고 유리 피펫을 사용하여 배지와 함께 DRG를 15ml 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 유리 피펫으로 위아래로(약 8-10회) 피펫팅하여 DRG 뉴런을 부드럽게 해리합니다(플라스틱 팁을 대안으로 사용할 수 있음).
- 펠릿이 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 새 튜브에 매체를 수집합니다. 펠릿이 들어 있는 튜브에 새로운 F12 배지 2ml를 추가하고 유리 피펫으로 기계적 해리를 반복합니다. 현탁액이 균질해질 때까지(약 3-4회) 이 단계를 반복하고 해리된 모든 DRG를 새 튜브에 수집합니다. 이 방법은 기계적 해리에서 파생되는 스트레스를 줄이고 뉴런의 생존력을 향상시킵니다.
- 이렇게 생성된 균질화된 현탁액을 100μm 세포 여과기를 사용하여 새로운 15ml 튜브로 여과하여 해리되지 않은 뉴런 및 기타 파편을 제거합니다. 이 단계에서는 먼저 세포 현탁액을 50ml 튜브로 여과한 다음 유리 피펫을 사용하여 용액을 더 작은 튜브로 옮기는 것이 편리할 수 있습니다. 현탁액을 110g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 500μl의 F12 배지에 500μl의 30% BSA 용액을 첨가하여 15% BSA를 준비합니다. 용액을 15ml 튜브의 벽을 따라 천천히 피펫으로 주입하여 점진적인 단백질 흔적을 만듭니다. 이 단계에서는 튜브를 45° 각도로 잡고 매 튜브의 숫자를 성형 "트랙"에 대한 참조로 사용하여 BSA를 천천히 해제하는 것이 도움이 됩니다.
- 2.10단계에서 상등액을 흡입하고 튜브 바닥에 500μl를 남기고 동일한 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 2.11단계에서 미리 준비한 단백질 흔적을 따라 현탁액을 천천히 피펫팅하고(튜브의 숫자를 참조로 사용) 500g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡입하고 변형된 BS 배지 1ml에 펠릿을 재현탁
메모: DRG 뉴런을 다시 현탁시키기 위한 부피는 원하는 최종 세포 농도와 파종할 샘플의 수에 따라 필요한 실제 부피까지 만들 수 있습니다. 한 마리의 동물은 24웰 플레이트 실험에 충분한 세포를 제공합니다.
- 파종된 샘플을 37°C, 5% CO2에서 2시간 동안 배양하여 세포 부착을 허용하고 마지막으로 50ng/ml의 NGF가 보충된 새로운 BS 배지를 추가합니다.
