Transient DMSO Treatment를 통한 줄기세포 분화 강화

초록

출처: Sambo, D. et al., 분화 촉진을 위한 DMSO를 사용한 인간 만능 줄기세포의 일시적 치료. J. Vis. 특급 (2019)

이 동영상은 G1기에서 세포를 정지시키는 일시적인 DMSO 처리로 줄기세포 분화를 향상시키는 방법을 보여줍니다. 처리 후, BMP 및 TGF-β 억제제와 함께 외배엽 분화 배지를 첨가하여 신경 전구체 형성을 촉진합니다.

프로토콜

1. 줄기세포 유지 관리

참고: 아래에 설명된 세포 유지 프로토콜은 부착 단층에서 유지되는 만능 줄기 세포(PSC)에 적용됩니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 처리 전에 사용되는 배지, 기타 시약 및 세포 배양 플레이트는 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 이 원고에 있는 다음 모든 프로토콜에 대해 세포는 생물학적 안전 캐비닛에서 처리되어야 합니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 준비된 만능 줄기 세포 적격 매트릭스 또는 기질로 멸균 6웰 조직 배양 처리된 플레이트를 코팅하고 CO₂ 인큐베이터(5% CO₂, 습한 분위기)에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 코팅된 플레이트는 필름으로 감아서 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 동결 보존된 PSC를 37°C 수조에서 해동합니다. 생물 안전 캐비닛에 도입하기 전에 바이알을 에탄올로 멸균한 다음, 5-10 부피의 예열된 줄기 세포 배지가 들어 있는 멸균 원뿔형 튜브에 피펫팅하여 세포를 즉시 옮깁니다.
3. 실온(RT)에서 300 x g에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다.
4. 배지를 흡인하고 Y-27632와 같은 10μM rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제가 보충된 1mL의 줄기세포 배지에 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다.
5. 플레이트에서 배양 매트릭스를 흡인하고 원하는 밀도(일반적으로 웰당 최소 2mL의 줄기 세포 배지에서 웰당 0.5-1 x 10⁶개 세포)로 세포를 시드합니다.
   메모: 도금 밀도는 세포주와 클론에 따라 달라질 수 있으며 그에 따라 최적화해야 합니다.
6. 매일 예열된 줄기세포 배지로 교체하여 세포를 유지하십시오. 대략 70%-80% 포화도에서 또는 세포 군체가 접촉하기 시작할 때 세포를 분할합니다.
7. 세포 분할의 경우 배지를 흡인하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다. 웰당 1mL의 해리 효소 용액으로 세포를 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
8. 예열된 줄기세포 배지로 세포를 세척하고 재현탁시킨 후 5-10부피의 줄기세포 배지가 있는 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1.3-1.7 단계에 따라 셀을 플레이트합니다.

2. DMSO 전처리

참고: 분화 전에 DMSO 전처리를 위해 세포를 도금할 때, 줄기세포주의 일반적인 성장률과 사용되는 분화 프로토콜을 고려하여 시작 도금 세포 밀도를 최적화해야 합니다. 필요에 따라 기존 마커를 사용하여 다능성을 검증합니다. 세포는 분화 전에 초기 해동 후 최소 1x-2x 계대에서 배양되어야 합니다.

1. 2D 배양 차별화
   1. 세포가 적절한 포화도에 도달하면 코팅된 플레이트를 준비하고, 세포를 해리하고, 위에서 설명한 대로 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
   2. 혈구계 또는 트리판 블루 또는 다른 생존력 마커를 포함한 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
   3. 10μM ROCK 억제제를 사용하여 줄기세포 배지의 웰당 0.5-1 x 10⁶개 세포로 코팅된 6웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다.
      참고: 본 실험실에서 테스트한 세포주의 경우, 이러한 밀도는 일반적으로 24시간 DMSO 전처리 내에서 80%-90%의 세포가 융합되는 결과를 낳았습니다.
   4. 세포가 CO₂ 인큐베이터(5% CO₂, 습한 대기)에서 37°C에서 24시간 동안 배양할 수 있도록 합니다.
   5. 예열된 줄기세포 배지에서 1%-2% DMSO를 준비합니다(예: 10mL 배지 내 100μL DMSO = 1% DMSO 용액 또는 10mL 배지 내 200μL DMSO = 2% DMSO 용액).
   6. 24시간 배양 후 세포에서 배지를 흡입하고 DMSO 용액으로 교체합니다.
   7. 분화 전에 세포가 37°C에서 24시간에서 48시간 동안 CO₂ 배양기(5% CO₂, 습한 분위기)에서 배양하도록 합니다.
      참고: 일반적으로 24시간 DMSO 처리는 대부분의 인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포(ESC 및 iPSC) 라인에 걸쳐 충분합니다. 성장 속도가 매우 느리고(배가 시간이 긴 세포주) DMSO를 사용한 48시간 배양의 이점을 얻을 수 있습니다. DMSO를 사용한 48시간 배양의 경우, 처리 첫 24시간 후에 배지를 1%-2% DMSO가 있는 새로운 줄기세포 배지로 교체할 수 있습니다.

3. 1차 생식층의 분화

참고: 다음은 6개의 웰 플레이트에서 단층으로 성장한 PSC에 대해 이전에 실험실에서 효과적인 것으로 나타난 방법을 설명합니다. 원하는 계통으로의 분화를 촉진하기 위해 DMSO 처리 후에 선택한 분화 프로토콜을 사용해야 합니다. 24-48시간 처리 후 DMSO 용액을 제거하고 표준 프로토콜에 따라 분화를 진행합니다.

1. 외배엽 분화
   1. 2D 배양을 위해 위에서 설명한 대로 DMSO로 세포를 전처리합니다.
   2. Noggin 및 SB431542 재고 솔루션을 준비합니다.
   3. knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 KOSR(knockout serum replacement)을 최종 농도 10%로 용해하여 외배엽 분화 기본 배지를 준비합니다.
      메모: 3-4일 동안 미디어를 교체할 수 있도록 충분한 기본 미디어를 준비합니다.
   4. Noggin을 500ng/mL의 최종 농도에 추가하고 10μM의 최종 농도로 SB431542 예열된 KOSR/녹아웃 DMEM의 적절한 부피로 외배엽 분화 배지를 준비합니다.
   5. DMSO 전처리 후 세포의 배지를 흡입하고 분화 배지(예: 6웰 플레이트의 웰당 2mL)로 교체합니다.
   6. 세포가 CO₂ 인큐베이터(5% CO₂, 습한 대기)에서 37°C에서 3-4일 동안 배양할 수 있도록 하고 매일 배지를 새로 추가된 분화 인자로 교체합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6-well Clear Flat Bottom TC 처리된 Multiwell 세포 배양 플레이트	코 닝	353046
Countess II FL 자동 세포 계수기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	AMQAF1000
DMEM/F-12	지브코	11320033
디엠소	시그마-알드리치	D2650
녹아웃 DMEM	지브코	10829018
Knockout 세럼 교체	지브코	10828028
마트리겔 매트릭스	코 닝	354277
Noggin Fc 키메라 단백질	R&D 시스템	제3344-NG-050
SB431542	줄기 탐지기	04-0010
초저 부착 마이크로플레이트	코 닝	3471
Y-27632	스템셀 기술	72302

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