성체 쥐의 척수 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 전구 세포의 격리

초록

출처: Mothe, A., et al., 성체 쥐와 인간 척수의 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기/전구 세포의 격리. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 성체 쥐의 척수 뇌실 주위 조직에서 신경 줄기/전구 세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 기술에는 단백질 분해 효소가 포함된 용액에서 조직 조각을 배양하여 세포 외 기질을 파괴하고 세포를 방출하는 것이 포함됩니다. 그 후, 방출된 세포는 신경 줄기/전구 증식을 강화하고 3차원 신경구로의 응집을 촉진하는 특정 성장 인자를 포함하는 배지에 도금됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 해부 버퍼 및 배양 배지 준비

1. 쥐 척수를 분리하기 위해 100ml 박리 완충액(1x PBS + 0.6% 포도당 + 2% 페니실린-스트렙토마이신)을 준비하고 냉장 보관합니다.
2. 100ml의 무혈청 배지(SFM)를 준비하고 37°C에서 예열합니다. SFM을 준비하려면 Neurobasal-A 배지에 2mM L-글루타민, 100μg/ml 페니실린-스트렙토마이신, 2% B27 및 10% 호르몬 혼합물을 추가합니다. 호르몬 혼합물을 준비하려면 0.6% 포도당, 3mM NaHCO₃, 5mM HEPES, 25μg/ml 인슐린, 100μg/ml 아포-트랜스페린, 10μM 푸트레신, 30nM 셀레늄 및 20nM 프로게스테론을 포함하는 1:1 DMEM/F12 배지를 만듭니다.
3. EFH 성장 인자 강화 도금 매체(SFM에 20ng/ml EGF, 20ng/ml bFGF 및 2μg/ml 헤파린 추가)를 준비하고 37°C에서 예열합니다.

2. 성체 쥐 뇌실 주위 척수 조직의 채취 및 해부

1. 해부 기구를 에탄올로 소독하고 멸균 식염수 또는 오토클레이브 기구로 미리 헹굽니다. 생후 6-8주령의 쥐에게 펜토바르비탈나트륨(65mg/ml에서 1cc)을 치사량으로 주사하거나 기관에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 마취제(즉, 4% 이소플루란)를 과다 투여합니다. 쥐의 등에 70% 에탄올을 바르고 큰 해부 가위로 등 표면의 피부를 제거합니다.
2. 가위를 등쪽 표면에 수직으로 잡고 뒷다리 위의 척추를 가로로 자릅니다. 더 작은 가위를 사용하여 척추 위에 있는 등쪽 근육을 세로로 자르고 척추 방향으로 잘라 가시돌기를 노출시킵니다.
3. 노출된 꼬리 끝에서 시작하여 척수와 척추 사이의 공간에 있는 척추관의 측면에 경막외 부위 또는 작은 뭉툭한 뼈 절단 기구를 삽입합니다. 얇은 판(척추뼈 양쪽에 있는 가시돌기의 왼쪽과 오른쪽에 있는 뼈 아치)을 작게 자르고 얇은 판을 조심스럽게 벗겨내어 척수를 노출시킵니다(그림 1A-D). 블레이드의 각도가 얕고 탯줄과 평행한지 확인하여 아래에 있는 척수가 손상되지 않도록 합니다.
4. 흉추와 경추 척수를 노출시키기 위해 꼬리 방향으로 후판 절제술을 계속합니다.
5. 뭉툭한 조직 집게로 척추에서 척수를 부드럽게 절제하고 마이크로 가위를 사용하여 뿌리를 조심스럽게 절단하여 탯줄을 풀어줍니다. 절제된 척수를 4°C 멸균 쥐 해부 완충액(위의 1.1에서 설명)이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 새로 준비한 4°C 절제 완충액으로 조직을 헹구고 가위를 사용하여 척수를 가로로 1cm 세그먼트로 자릅니다(그림 1E).
6. 조직의 각 부분에 대해 한 손을 사용하여 미세한 집게로 조직을 잡습니다. 다른 한편으로는 마이크로 가위를 사용하여 해부 스코프를 사용하여 위에 있는 수막, 백질 및 대부분의 회백질을 조심스럽게 제거합니다. 또는 미세한 집게(Dumont #4)를 사용하여 회백질의 대부분을 벗겨내고 뇌실막과 소량의 주변 회백질을 포함하는 척수의 뇌실 주위 영역만 남깁니다(그림 1F-H).
7. 절개된 뇌실 주위 조직을 차가운 쥐 박리 완충액이 들어 있는 10cm 멸균 페트리 접시에 모읍니다.

3. 성체 쥐 척수 NSPC의 격리 및 배양

1. 층류 후드에서 다음 단계를 무균 상태로 수행합니다.
   1. 절개된 쥐의 뇌실 주위 조직을 마이크로 가위로 1mm 조각으로 다집니다.
   2. 재료/시약 표에 표시된 대로 파파인 해리 키트를 사용하여 다진 조직을 단백질 분해 효소로 효소로 효소적으로 해리합니다.
      메모: 시약 구성 요소에는 4개의 바이알이 포함됩니다.바이알 1: Earle's Balanced Salt Solution(EBSS). 바이알 2: L-시스테인과 EDTA를 함유한 파파인. 바이알 3: 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase). 바이알 4: 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 오보뮤코이드 프로테아제 억제제.
      참고: 파파인은 단백질 기질에 대한 특이성이 넓은 설프히드릴 프로테아제입니다. 본원의 파파인은 Carica 파파야 식물의 라텍스에서 추출되었으며 췌장 프로테아제보다 대부분의 단백질 기질을 더 광범위하게 분해합니다. 해리 과정에서 DNA가 해리 매질로 방출되는 일부 세포 손상이 있으며, 이로 인해 점도가 증가하고 파이펫팅이 어려워집니다. 따라서 DNase는 손상되지 않은 세포를 손상시키지 않고 DNA를 소화하기 위해 세포 분리 절차에 포함됩니다. 오보뮤코이드는 해리 단계 후 파파인 활성을 억제하는 데 사용되는 당단백질 단백질 분해효소 억제제입니다.
2. 최초 사용 시 알부민 오보뮤코이드 억제제 혼합물(바이알 4)을 EBSS 32ml(바이알 1)로 재구성한 후 4°C에서 보관하고 후속 분리에 사용합니다. 메모: 이것은 ml당 10mg의 오보뮤코이드 억제제와 10mg의 알부민의 유효 농도에서 용액을 생성합니다.
3. 파파인 바이알(바이알 2)에 EBSS(바이알 1) 5ml를 첨가하여 0.5mM EDTA가 있는 1mM L-시스테인에 20단위의 파파인/ml 용액을 생성합니다. 파파인 용액이 완전히 용해되었을 때 투명하게 나타나는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 파파인이 완전히 용해될 때까지 바이알을 37°C 수조에 10분 동안 넣어 효소의 전체 활성을 보장합니다.
4. DNase 바이알(바이알 3)에 EBSS(바이알 1) 500μl를 첨가하고 DNase는 전단 변성에 민감하므로 부드럽게 혼합합니다. 250 μl의 DNase 용액을 파파인 바이알에 첨가하여 약 20 units/ml 파파인 및 0.005% DNase의 최종 농도를 얻습니다. 나중에 사용할 수 있도록 나머지 DNAse를 저장합니다.
5. 다진 쥐 조직을 파파인 용액에 넣습니다.
6. 37°C에서 로커 플랫폼에서 지속적으로 교반하여 활성화된 파파인 용액에서 조직을 분리하여 배양합니다. 쥐 조직을 45분에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 10ml 피펫으로 혼합물을 분쇄하여 남아 있는 조직 조각을 해리하여 탁한 세포 현탁액을 생성합니다. 세포 현탁액(해리되지 않은 조직 조각은 포함하지 않음)을 멸균 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리합니다.
8. 펠렛화된 세포를 파파인 억제제인 오보뮤코이드(ovomucoid)를 함유한 배지에 재현탁시킵니다.
   1. 15ml 원뿔형 튜브에 2.7ml EBSS(바이알 1)와 300μl의 재구성된 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(바이알 4)을 혼합하여 오보뮤코이드 용액을 준비합니다. DNase 용액 150μl(바이알 3)를 추가합니다.
   2. 펠릿화된 세포에서 상등액을 버리고 즉시 희석된 DNase 알부민 억제제 혼합물에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
9. 단일 단계 불연속 밀도 구배를 통한 원심분리를 통해 세포막에서 온전한 세포를 분리합니다.
   1. 15ml 튜브에 5ml의 알부민 억제제 용액(바이알 4)을 첨가하고 5ml 피펫을 사용하여 알부민 억제제 용액 위에 세포 현탁액(상기에서 설명한 대로 준비)을 부드럽고 천천히 층을 이룹니다.
   2. 70 x g에서 RT.
      에서 6분 동안 원심분리기 메모: 그래디언트의 두 레이어 사이의 계면은 명확하게 보여야 하지만 이 경계에서 최소한의 혼합은 결과에 영향을 미치지 않습니다. 막 조각은 계면에 남아 있고 해리된 세포는 튜브 바닥에 펠릿이 됩니다.
10. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1ml의 rat EFH 배지(37°C에서 예열)에 재현탁합니다. 혈구계로 살아있는 세포 밀도를 계수하고 EFH에서 10 cells/μl의 밀도로 T25 배양 플라스크에 세포를 플레이트화합니다. 쥐 조직에서 세포의 일반적인 수율은 약 2 x 10⁶ 세포이며 약 80 %의 생존율을 가지고 있습니다. 클론 배양이 필요한 경우, 10 cells/μl 미만의 밀도에서 세포를 종자화합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 플라스크를 배양하고 구체의 응집을 피하기 위해 1 주일 동안 배양물이 방해받지 않고 성장하도록합니다.

결과

그림 1. 쥐 척수의 후층 절제술 및 뇌실 주위 부위 절제술. (A) 척수의 노출된 꼬리 끝에서, 척추관의 외측으로 룽거(rongeurs)가 경외적으로 삽입됩니다. (B) 척추뼈의 양쪽에 있는 얇은 판에 작은 상처를 내고 얇은 판을 조심스럽게 벗겨내어 척수를 노출시킵니다. (C) 후판 절제술 후 노출된 경추 척수. (D) 척수와 후판 절제술을 위해 만들어진 절단의 위치를 보여주는 흉추 단면의 개략도(빨간색 점선으로 묘사). 얇은 판과 가시 돌기(음영 처리된 영역)가 제거됩니다. (E) 척수를 가로로 1cm 분절로 절단합니다. (F) 위에 있...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS 1개	생명 기술	#10010023	해부 버퍼
HBSS 1개	생명 기술	#14175095	해부 버퍼
D-포도당	시그마	# G-6152	해부 완충액과 호르몬 혼합물을 위한 30% 포도당 스톡 용액을 준비합니다
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	#의 15140-148	해부 완충액 및 배양 배지
뉴로베이스알-A	생명 기술	#의 10888-022	문화 매체
L-글루타민, 200mM	생명 기술	#의 25030-081	문화 매체
나27	생명 기술	#12587010	문화 매체
DMEM을 참조하십시오.	생명 기술	#11885084	호르몬 믹스
F12	생명 기술	#의 21700-075	호르몬 믹스
나HCO3	시그마	# S-5761	호르몬 혼합을 위한 7.5% NaHCO3 원액 준비
헤페스	시그마	#H9136	호르몬 혼합을 위한 1M HEPES 원액 준비
인슐린	시그마	#I-5500	호르몬 믹스
아포 트랜스페린	시그마	#T-2252	호르몬 믹스
푸트레신	시그마	# P7505	호르몬 믹스
셀레늄	시그마	#S-9133	호르몬 믹스
프로게스테론	시그마	#P-6149	호르몬 믹스
EGF, 마우스	시그마	#E4127	B27 및 분취액에 100μg/ml 스톡을 준비합니다. EFH 매체
bFGF, 인간 재조합	시그마	#F0291	B27 및 분취액에 100μg/ml 스톡을 준비합니다. EFH 매체
헤파린, 10,000 U	시그마	#H3149	호르몬 혼합물 및 분취액에 27.3 mg/ml 스톡을 준비합니다. EFH 매체
파파인 해리 키트	워딩턴 생화학 물질	#LK003150	BSA가 있는 EBSS, 파파인, DNase, 오보뮤코이드 프로테아제 억제제 함유
나트륨 펜토바르비탈	비메다 – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
조직 겸자: 애디슨	정밀 과학 도구	#의 11006-12	톱니 모양의 표준 팁, 마이크로 팁도 사용 가능
가는 집게: Dumont #4	정밀 과학 도구	#의 11241-30
마이크로 가위	정밀 과학 도구	#의 15024-10	라운드 핸들 반나
롱거스	바우쉬 & 롬	N1430
10mm 페트리 접시	눕크	1501
T25 배양 플라스크	눕크	156367
6웰 플레이트	눕크	CA73520-906