Isolating and Culturing Mouse Cerebral Pericytes(쥐 대뇌 주위 세포의 분리 및 배양)

초록

출처: Mehra, A., et al., 마우스에서 대뇌 주위 세포를 분리하는 고출력 방법. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 대뇌 주피세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포는 주피세포 증식을 촉진하기 위해 주피세포 특이적 배지에서 배양됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 500mL의 세척 버퍼 A(WBA): 10mM HEPES 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 500mL의 세척 버퍼 B(WBB): 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 10mM HEPES 용액을 HBSS에 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
3. 300% 덱스트란 용액 300mL를 실온에서 하룻밤 동안 혼합하여 WBA에 준비합니다. 사용하기 전에 110°C에서 30분 동안 용액을 오토클레이브합니다. 오토클레이빙 후 용액을 실온에서 2-3시간 동안 그대로 두십시오. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
4. 저온 덱스트란 용액에 0.1% BSA 용액 100mL를 준비합니다. 3-4분 동안 세게 흔든 후 4°C에서 보관합니다.
5. 송아지 혈청 20%, 글루타민 2mM, 겐타마이신 50μg/mL, 비타민 1%, 아미노산 BME(Basal Medium Eagle) 2%를 Basal DMEM 배지에 용해시켜 Dulbecco's Modified Eagle(DMEM) 배지 전체를 준비하고 4°C에서 보관합니다.사용 전에 1ng/mL 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 추가합니다.
주피세포
6. 배양 기저 배지에 주피세포 성장 보조제(주피세포 배지와 함께 제공)와 20% 태아 송아지 혈청(FCS)을 첨가하여 완전한 주피세포 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.

2. 뇌 조직 회복 및 수막 제거

1. 일관성을 위해 모든 추출 배치에서 비슷한 연령과 성별의 마우스를 사용하십시오. 병원체가 없는 동물 보호소를 이용하고 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 하십시오. 효율성을 보장하고 동물을 최소한으로 사용하려면 조직 재료의 손실을 피하십시오.
2. 생후 4-6주 된 수컷 마우스 C57BL/6J를 안락사시킵니다(Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, France).
3. 무균 상태에서 뇌 조직을 신속하게 절제하고 조직 손상을 방지합니다. 조직을 40mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)에 조심스럽게 넣습니다.
4. 차가운 PBS의 뇌 조직을 페트리 접시(100mm x 15mm)로 옮깁니다.
5. 보푸라기가 없는 멸균된 마른 물티슈에 뇌 조직을 놓고 구부러진 팁 집게로 소뇌, 선조체 및 후두 신경을 제거합니다.
   1. 면봉으로 눈에 보이는 모든 수막을 제거하십시오. 뇌 조직을 거꾸로 놓고 면봉으로 바깥쪽을 가볍게 스트로크하여 엽을 엽니다. 눈에 보이는 모든 혈관을 제거하십시오.
   2. 수막이 없는 뇌 조직을 100mL의 차가운 WBB와 함께 페트리 접시(15mm x 15mm)에 넣습니다.

3. 균질화

1. 조직을 Dounce 조직 분쇄기 모르타르 튜브로 옮기고 집게로 3-4mL의 WBB를 추가합니다.
2. '느슨한' 절굿공이로 조직을 55번 다집니다. WBB로 '느슨한' 유봉을 헹굽니다. 이제 "꽉 조인"절굿공이로 슬러리를 25 번 다집니다.
3. 슬러리를 50mL 튜브 2개로 균등하게 나누고 차가운 30% BSA-덱스트란의 1.5배 부피를 넣고 튜브를 세게 흔들어 슬러리를 혼합합니다.

4. 혈관 분획의 분리

1. 튜브를 세게 흔든 후 3,000 x g 및 4°C에서 25분 동안 튜브를 원심분리합니다.
2. 상층액(상단 미엘린 층과 함께)을 2개의 새 튜브로 옮기고 3,000 x g 및 4°C에서 25분 동안 튜브를 원심분리합니다. 차가운 WBB 3mL를 추가하여 첫 번째 원심분리에서 펠릿을 보존합니다(펠릿을 4°C로 유지).
3. 4.2단계를 반복하고 2차 원심분리에서 펠릿을 조심스럽게 보존합니다.
4. 4.3단계에서 튜브에서 조직 파편이 있는 덱스트란과 미엘린을 폐기합니다. 펠릿을 차가운 WBB에 보관하십시오.
5. 단계 4.1에서 튜브 1과 튜브 2의 내용물을 풀링하고 차가운 WBB로 최종 부피 10mL까지 구성합니다.
6. 4.2단계 및 4.3.
   단계의 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다. 참고: 마지막으로 3개의 원심분리에서 3개의 튜브가 있습니다.
7. 10mL 피펫을 사용하여 펠릿 덩어리가 눈에 띄지 않을 때까지 6번의 위아래 스트로크를 사용하여 펠릿을 해리합니다.
8. 진공 필터 어셈블리와 나일론 메쉬 필터를 사용하여 각 튜브의 셀 현탁액을 필터링합니다.
   메모: 이 여과 단계는 메쉬 필터를 통해 더 길거나 큰 용기를 제거하는 데 중요합니다.
9. 실온에서 평평한 팁 집게 또는 WBB의 스크레이퍼를 사용하여 필터를 긁어 모세혈관을 복구하고 다시 부유시킵니다. 더 많은 모세혈관을 회수하기 위해 새 필터로 현탁액을 여과
합니다.
10. 여과액을 두 개의 튜브로 균등하게 나누고 1,000 x g 및 RT.
    에서 7분 동안 원심분리합니다. 참고: 이 원심분리 단계에서 효소 용액을 준비합니다. 사용된 동물의 수에 따라 필요한 WBB의 부피를 결정합니다(재료 표 참조). WBB에 DNase 1 1x와 Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochloride (TLCK) 1x(재료 표 참조)를 넣고 37 °C로 예열합니다.
11. 4.10단계의 펠릿을 효소가 함유된 예열된 WBB로 하나의 튜브에 수집합니다. 예열된 1x 콜라겐 분해 효소/디스파제를 추가합니다. 튜브를 37°C의 흔들리는 테이블 수조에 정확히 33분 동안 놓습니다.
12. 차가운 WBB 30mL를 첨가하여 효소 반응을 중지합니다. 현탁액을 1,000 x g에서 7분 동안 원심분리하고 실온합니다.
13. 상등액을 조심스럽게 버리고 10mL 피펫을 사용하여 6번의 위아래 스트로크로 WBB에서 펠릿을 해리합니다. 이 단계는 덜 엄격하고 비교적 빨라야 합니다.
14. 1,000 x g 및 RT.
    에서 7분 동안 서스펜션을 원심분리합니다. 참고: 이 단계에서 배양 접시의 코팅을 버리고 실온에서 DMEM으로 한 번 헹굽니다. RT에서 최소 1시간 동안 세포 배양 접시를 코팅합니다.
15. 단계 4.14에서 얻은 튜브에서 상등액을 버리고 새로운 완전한 DMEM 배지에서 펠릿을 해리하고 6웰 플레이트의 9웰(각각 9.6cm2의 1웰)에 세포(Day 0, P0)를 플레이트
화합니다.

5. 대뇌 pericyte의 증식

1. 멸균 인큐베이터에서 세포 배양을 37°C 및 5% CO₂로 유지합니다. 세포를 도금한 후 24시간(1일) 후에 배양 배지를 조심스럽게 제거하여 배양 배지를 교체합니다. 1일차 이후에는 48시간마다 배양 배지를 교체합니다.
2. 최소 7-8일 동안 세포 배양을 관찰합니다. 이때쯤이면 내피 단층 상부의 세포 성장이 관찰될 수 있어야 합니다.
3. 8-10일째(포화도에 따라 다름)에 pericyte 배양 배지에서 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트의 passage 1(P1)까지 세포를 계대형성합니다. 2일마다 배양 배지를 변경합니다. 6-7일 동안 세포를 관찰하십시오. 세포는 17일째에 계대 2(P2)로 다시 연속적으로 분할되며[필요한 경우에만 24일째에 계대 3(P3)]로 분열되며, 젤라틴으로 코팅된 플레이트의 주위 세포 배지에서 성장합니다.
   메모: 세포는 거의 80-90%의 포화도에서 실험/관찰 준비가 되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아미노산 BME	시그마	나-6766	4 °C에서 보관하십시오.
Basal DMEM 배지	인비트로젠	316000083	4 °C에서 보관하십시오.
기본 섬유아세포 성장 인자	시그마	F-0291	-20 °C에서 보관하십시오.
증권 시세	시그마	A-8412	4 °C에서 보관하십시오.
콜라겐분해효소 디스페이스	시그마	10269638001	멸균 PBS-CMF에 10x 원액을 준비합니다. 0.22μm 주사기 필터로 용액을 여과하고 -20°C에서 보관합니다. 참고: 프로토콜의 효소 분해 단계에서는 추출을 위한 10개의 마우스 세트당 300μL의 10x 콜라겐분해효소 분산효소가 필요합니다.
덱스트란	시그마	31398
DNase I	시그마	11284932001	1000mg을 10ml 멸균수에 용해시켜 1000X 원액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
젤라틴	시그마	G-2500	멸균 PBS-CMF(8g/L NaCl, 0.2g/L KCl, 0.2g/L KH2PO4, 2.86g/L NaHPO4(12H2O), pH 7.4)에 0.2% 젤라틴 용액을 만들어 작업 코팅을 준비합니다. 용액을 120°C에서 최소 20분 동안 오토클레이브하고 실온에서 보관하십시오. 배양 접시는 4 °C에서 최소 4 시간 동안 코팅해야합니다.
겐타마이신	바이오크롬 AG	A-2712	4 °C에서 보관하십시오.
글루타민	머 크	I.00289	-20 °C에서 보관하십시오.
HBSS (하이브에스)	시그마	H-8264	4 °C에서 보관하십시오.
헤페스	시그마	H-0887	4 °C에서 보관하십시오.
마트리겔	BD 바이오코트	제354230	저온 DMEM에서 스톡을 1:48 비율로 희석하고 최종 농도가 85μg/cm2가 되도록 하여 Matrigel의 작업 코팅 용액을 준비합니다. 세포 배양 접시는 실온에서 최소 1시간 동안 코팅해야 합니다.
Pericyte 미디엄 마우스	사이언스엘 연구소	1231	4 °C에서 보관하십시오.
토실 리신 클로로메틸 케톤	시그마	T-7254	WBA 10.88mL에 16mg을 용해시켜 WBA에 1000X 원액을 준비하여 4mM 용액을 만들고 4°C에서 보관합니다.
비타민	시그마	나-6891	-20 °C에서 보관하십시오.
여과 도구	Sefar, 나일론 메쉬, 60미크론 다공성
실험실 장비	스윙 버킷 로터 원심분리기
교반기가 있는 수조
층류 후드 : BSL2
유리 제품(모든 구성 요소는 가열 멸균)	Dounce 티슈 그라인더와 유리 유봉
유봉 I: 0.0035 - 0.0065인치
유봉 II: 0.0010 - 0.0030 인치
거친 다공성 프릿 유리 필터 지지대가 있는 진공 필터 어셈블리