Obtaining a Single-Cell Suspension from Mouse Hippocampal Tissue

초록

출처: Trujillo, M., et al. 마우스 뇌 해마 조직의 결합된 기계적 및 효소적 해리. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 자동화된 기계적 해리와 효소 혼합물의 조합을 사용하여 쥐의 뇌 해마에서 생존 가능성이 높은 단일 세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 각 샘플에 대해 Enzyme Mix 1과 2를 준비합니다

.

참고: 2 mL 이상의 부피는 10 mL 혈청 파이펫을 사용하고, 200 μL-2 mL 용량의 경우 1000 μL 파이펫을 사용하고, 21-199 μL 용량의 경우 200 μL 파이펫을 사용하고, 2-20 μL 볼륨의 경우 20 μL 파이펫을 사용하고, 2 μL 미만의 부피는 0-2 μL 파이펫을 사용합니다.

1. 각 샘플에 대해 Enzyme P와 Enzyme A를 각각 1개의 부분 표본을 실온에서 해동합니다.
2. Enzyme mix 1의 경우, 50 μL의 Enzyme P와 1900 μL의 Buffer Z를 라벨이 부착된 C 튜브에 결합합니다(Table of Materials).
3. 효소 혼합물 2의 경우, 20μL의 Buffer Y를 해동된 10μL의 효소 A의 분취액에 추가합니다.

2. 성인 뇌 해리 프로토콜

참고: 샘플로 작업할 때 튜브는 실온의 튜브 랙에 넣어야 하며 BSA 및 D-PBS는 달리 명시되지 않는 한 얼음 위에 있어야 합니다.

1. 디스소레이터를 켭니다.
2. 집게를 사용하여 해마 조직 조각을 C 튜브로 옮깁니다.
3. 30 μL의 Enzyme mix 2를 C 튜브로 옮깁니다. 장력이 느껴질 때까지 캡을 비틀었다가 딸깍 소리가 날 때까지 조입니다.
4. C Tube를 dissociator의 위치에 거꾸로 놓습니다. 샘플에 Selected(선택됨) 상태가 할당됩니다(그림 1). C 튜브 위에 히터를 고정합니다.
5. 폴더 아이콘을 누르고 즐겨찾기 폴더를 선택한 다음 스크롤하여 37C_ABDK_02 프로그램을 선택합니다. OK(확인)를 클릭하여 선택한 모든 C 튜브에 프로그램을 적용한 다음 Start(시작)를 누릅니다(그림 1).
6. 샘플당 50mL 코니컬 튜브 1개에 라벨을 부착합니다.
7. 각 50mL 코니컬 튜브에 70μm 세포 여과기를 놓고 2mL의 BSA 완충액으로 적십니다.
8. 프로그램이 완료되면 해리레이터에서 히터와 C 튜브를 제거합니다.
9. 샘플에 BSA 완충액 4mL를 추가하고 혼합물을 50mL 원뿔형 튜브의 세포 여과기에 적용합니다.
10. C-튜브에 D-PBS 10mL를 넣고 닫은 다음 용액을 부드럽게 휘젓습니다. 50mL 코니컬 튜브의 세포 여과기에 적용합니다.
11. 세포 여과기와 C 튜브를 폐기합니다. 현탁액을 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 흡인하고 버립니다.

3. 파편 제거

1. 펠릿을 1550μL의 차가운 D-PBS로 재현탁하고 현탁액을 표지된 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
2. 450μL의 차가운 파편 제거 용액과 피펫을 위아래로 추가합니다(와류가 발생하지 않음).
   메모: Debris Removal Solution은 상업용 Adult Brian Dissociation Kit의 시약입니다.
3. 1mL의 차가운 D-PBS를 세포 현탁액 위에 부드럽게 오버레이하고 팁을 원뿔형 튜브의 벽에 대도록 합니다. 총 오버레이가 2mL가 될 때까지 반복합니다.
   메모: 이 단계는 매우 중요합니다. 능숙하고 민첩하게 수행하십시오.
4. 3000 x g에서 4°C에서 10분간 완전 가속 및 완전 제동 상태에서 원심분리기.
   메모: 단계가 명확하게 구분되지 않은 경우 7.2-7.3단계를 반복합니다. 1000 x g에서 4°C에서 10분 동안 마지막으로 원심분리기를 합니다.
5. 이제 서스펜션은 세 개의 별개의 레이어로 구성되어야 합니다(그림 2). 맨 위 레이어를 흡인합니다. 피펫 팁을 앞뒤로 쓸어 흰색 중간층을 흡인합니다. 맨 아래 레이어를 방해하지 않고 중간 레이어를 최대한 제거합니다.
   메모: 이 단계는 매우 중요합니다. 능숙하고 민첩하게 수행하십시오.
6. 차가운 D-PBS 2mL와 피펫을 위아래로 넣어 섞습니다.
7. 1000 x g에서 4°C에서 10분간 완전 가속 및 완전 제동 시 원심분리기. 상층액을 흡인하고 버립니다. 펠릿을 BSA 완충액 1mL에 재현탁합니다.
   참고: 세포는 적절한 완충액에 재현탁한 다음 이 시점에서 단일 세포 염기서열분석을 준비하기 위해 자기 라벨링 및 분리할 수 있습니다.

결과

그림 1: 2.4단계에서 선택한 상태

그림 2: 3.5단계의 3층 현탁액: 완충액(상단 층), 세포 파편, 파편 제거 용액 및 세포(하단 층).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	전화: 02-682-003	Basix, 모듬 색상
15 mL 팔콘 튜브	Becton Dickinson Labware 유럽	352009	폴리스 티 렌
25 mL 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-955-235
70 μm 세포 스트레이너	피셔 사이언티픽	08-771-2
성인용 뇌 해리 키트	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-107-677	효소 P, 완충액 Z, 완충액 Y, 효소 A, 완충액 A, 파편제거 용액 함유
증권 시세	시그마-알드리치	A7906-50G
Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	번호 14-432-22
gentleMACS C 튜브	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-237
gentleMACS Octo 디스해리케이터(히터 포함)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-427
Gibco DPBS(1개)	써모피셔 사이언티픽	14190144
유리 비커	피셔 사이언티픽	02-555-25ᅡ
피펫 팁 GP LTS 20 μL 960A/10	라이닌	30389270
피펫 팁 GP LTS 250 μL 960A/10	라이닌	30389277
피펫 팁 RT LTS 1000 μL FL 768A/8	라이닌	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS(2, 20, 200, 1000 μL)	라이닌	30386597
뚜껑이 있는 둥근 얼음 양동이	피셔 사이언티픽	07-210-129
Cell Strainer Cap이 있는 Round-Bottom Tubes	송골매	Tel.: 100-0087

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