쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

초록

출처: DiSano, K. D., et al. 면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 뇌 및 척수 조직의 단세포 현탁액 준비

1. 튜브에서 조직과 매체를 부어 매체가 있는 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시 상단으로 옮깁니다. 집게를 사용하여 조직을 페트리 접시의 바닥으로 옮깁니다. 멸균 면도날로 뇌나 척수를 잘게 다집니다. 면도날을 사용하여 다진 조직을 긁어 접시 바닥으로 옮깁니다.
   메모: 아래의 효소 분해 프로토콜의 경우, 최대 2개의 척수를 함께 모아 처리할 수 있습니다. 뇌는 개별적으로 처리되어야 합니다.
2. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 3mL의 RPMI(Roswell Park Memorial Institute 배지(10% 태아 송아지 혈청(FCS)가 보충됨)를 페트리 접시에 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫을 사용하여 배지의 조직을 재현탁하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   메모: 다운스트림 애플리케이션이 단일 세포 또는 벌크 RNA 염기서열분석 또는 세포 배양인 경우, 분석 전에 세포가 활성화되지 않았는지 확인하기 위해 FCS 로트를 테스트해야 합니다. 또는 10% FCS의 RPMI 대신 0.04% BSA의 1x PBS를 사용하여 셀을 처리할 수 있습니다.
3. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 페트리 접시를 추가 2mL의 배지로 세척하여 잔류 조직을 수집하고 총 5mL 부피의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 가공 단계 사이에 튜브를 얼음 위에 두십시오.
4. 피펫을 사용하여 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 배지에 콜라겐분해효소 I 분말을 재현탁시켜 원하는 농도(즉, 100mg/mL)를 얻습니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 콜라겐분해효소 I형을 추가하여 원하는 최종 농도(즉, 1mg/mL의 경우 50μL)를 얻습니다.
   메모: 더 높은 농도의 콜라겐분해효소는 세포 수율을 증가시키지만 세포 표면 마커를 절단할 수 있습니다. 따라서 필요한 모든 세포 표면 마커가 손상되지 않은 상태에서 가장 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻는 데 필요한 최적의 농도를 결정하기 위해 콜라겐분해효소 I 로트를 적정해야 합니다. 예를 들어, 콜라겐분해효소 I은 단일 뇌 또는 척수 샘플에 대해 0.5mg/mL, 1mg/mL 및 2mg/mL의 최종 농도에서 테스트되었습니다. 세포 생존율은 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 측정하고 세포 표면 마커 CD45, CD19 및 CD4를 유세포 분석으로 평가했습니다. 1mg/mL 농도의 콜라겐분해효소 I은 모든 관심 세포 표면 마커를 유지하면서 가장 높은 살아있는 세포 수를 산출했습니다. 따라서, 이 농도는 이러한 세포 유형을 검사하는 추가 실험에 사용되었습니다.
5. 0.15M 염화나트륨을 사용하여 DNase I 분말을 원하는 스톡 농도로 부드럽게 재현탁합니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 재현탁된 DNase I을 추가하여 20 U/mL.
   의 최종 농도를 얻습니다. 메모: DNase I lots는 mL당 활성 단위에 따라 다릅니다. 조직 샘플에 첨가할 농도는 스톡 바이알의 밀리리터당 활성 단위에 따라 변경됩니다. 샘플당 최종 원하는 농도는 20U/mL입니다.
6. 튜브를 37°C 수조의 튜브 랙에 넣고 40분 동안 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직을 효소와 완전히 혼합합니다. 배양 후 0.01M EDTA의 최종 농도를 위해 각 튜브에 500μL의 0.1M EDTA(pH = 7.2)를 추가하고 추가로 5분 동안 배양하여 콜라겐분해효소를 비활성화합니다.
7. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 각 튜브에 10% FCS가 보충된 RPMI 9mL를 추가하여 각 튜브의 부피를 ~14.5mL로 만듭니다. 450 ° C에서 5 분 동안 4 x g에서 원심 분리기. 진공 상태에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠렛을 만지지 않도록주의하면서 상층액을 흡인합니다.
8. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 3mL의 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 세포 펠렛이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 10mL로 만들고 세포 펠렛을 재현탁하여 30% 스톡 등장성 밀도 구배 용액 층을 생성합니다.
   메모: 100% 스톡 등장성 밀도 구배 배지를 미리 준비하고 분취한 후 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다. 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 준비하려면 밀도 구배 매체(Table of Materials)를 밀도 구배 매체 희석 완충액으로 희석합니다. 밀도 구배 매체 희석 완충액(80.0 g/L NaCl, 3.0 g/L KCl; 0.73 g/L Na₂HPO₄, 0.20 g/L KH₂PO₄, 20.0 g/L 포도당)을 준비하고 진공 필터 시스템을 사용하여 필터 멸균합니다. 밀도 구배 희석 완충액의 1부와 밀도 구배 매체 9부를 혼합하여 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 만듭니다. 잘 섞는다.
9. 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액 밑받침을 추가하기 전에 각 튜브를 뒤집고 혼합합니다. 1mL의 70% 스톡 등장성 밀도 구배 용액이 들어 있는 1mL 혈청학 피펫을 튜브 바닥에 삽입합니다. 용액 1mL를 천천히 밑에 깔고 거품이 생기지 않도록 주의합니다. 그라디언트를 방해하지 않도록 주의하면서 튜브에서 혈청학적 피펫을 천천히 제거합니다.
   메모: 70% 언더레이의 경우, RPMI 매체(즉, 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액 7mL와 잘 혼합된 RPMI 매체 3mL)를 사용하여 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 70%로 희석해야 합니다. 또한 깨끗하고 방해받지 않는 70% 언더레이를 만드는 것은 미엘린 파편을 제거하고 원심분리 후 그래디언트 계면에서 순수한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필수적입니다.
10. 800 x g에서 4°C에서 30분간 브레이크 없이 원심분리기. 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 튜브에 2-3mL가 남을 때까지 미엘린 파편층을 포함한 상층액을 흡인합니다. 1 mL 피펫을 사용하여 30/70% 밀도 구배 사이의 세포층을 수확하고 새로운 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
11. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 15mL로 만듭니다. 원심분리기 450 x g 4°C에서 5분 동안 .
    메모: 이 단계에서 필요한 경우 두 튜브의 세포층을 풀링할 수 있습니다. 두 개 이상의 튜브를 모으지 마십시오. 그렇지 않으면 고밀도 구배 매체 농도로 인해 세포가 펠릿화되지 않습니다.
12. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상등액을 조심스럽게 흡입합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하기 위해 적절한 부피/완충액에 세포를 재현탁합니다(예: 다운스트림 표면 염색을 위해 250μL의 FACS 완충액에 단일 척수를 재현탁)(그림 1).
13. 1mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 필터 상단 튜브(Table of Materials)의 상단으로 옮기고 세포가 튜브 하단으로 여과되어 남아 있는 미엘린 파편을 제거하도록 합니다.
14. trypan blue exclusion dye를 사용하여 희석하고 정확도를 위해 최소 2 개의 16 제곱 그리드를 평균화하여 혈구 측정기에서 세포를 계산합니다 40 , 41.
15. 원하는 단일 세포 분석 기법을 계속 진행합니다.
    메모: 다양한 형태의 콜라겐분해효소(즉, D, 유형 I, 유형 II, 유형 IV), 면역 세포, 미세아교세포(그림 1), 성상세포, 주피세포, 내피 세포49 및 뉴런50을 모두 효율적으로 분리할 수 있습니다. 결과를 위해 얻은 핵 세포 수는 적정 콜라겐 분해 효소 I 효소를 사용하여 다음과 같았습니다 : 전체 가짜 처리 된 뇌 = 500,000-600,000 개의 세포; 전체 TMEV-IDD 뇌 = 800,000–1,000,000 세포; 가짜 처리된 척수 전체 = 150,000-200,000 세포; 전체 TMEV-IDD 척수 = 300,000–400,000. 세포 수는 수집, 처리의 정밀도 및 CNS 염증의 존재 여부에 따라 달라집니다.

결과

그림 1 : CNS 조직에서 면역 세포에 침투하는 CD45hi 식별. (A) 가짜 처리(빨간색) 또는 TMEV-IDD(파란색) 마우스의 척수에 있는 총 살아있는 세포 중 CD45hi 침투 면역 세포(P1), CD45lo 미세아교세포(P2) 및 CD45- 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뉴런을 식별하기 위한 게이팅 전략. 최소한의 CD45hi 세포가 가짜 처리된 뇌와 척수에서 검출되었습니다. (B) TMEV-IDD 마우스에서 CD45hi 침투 면역 세포(P1) 중 CD19+ B 세포 및 CD4+ T 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략. 게이팅 전략은 뇌와 척수 조직에 대해서도 유사했습니다. (C) 가짜 처리된 마우스(빨간색) 및 만성 TMEV-IDD 마우스(파란색)의 수막에서 CD45hi 세포(P1)를 식별하기 위한 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 세럼 알부민	써모피셔 사이언티픽	37002D
원심 분리기	벡크만 쿨터	Allegra X-12R 원심분리기
콜라겐분해효소 I	워 딩 턴	LS004196
원뿔형 튜브, 15 mL	폭스바겐	525-1069
원뿔형 튜브, 50 mL	폭스바겐	89039-658
커버 유리	하우저 사이언티픽	5000
곡선형 집게	정밀 과학 도구	11003-14
일회용 폴리스티렌 튜브, 14mL	피셔 사이언티픽	14-959-1B
DNase I	워 딩 턴	LS002139
드라이아이스	에어가스	해당 사항 없음
더몬트 #7Forceps	정밀 과학 도구	11271-30
EDTA 디소듐 염 디하이드레이트	암레스코	0105-500지
에탄올, 100%	어떤	해당 사항 없음
필터 상단 튜브, 5 mL	폭스바겐	352235
정착성 생존력 염색 780	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	565388
포도당	피셔 케미컬	D16-500
행크스 발크염 용액(HBSS)	코 닝	21-020-이력서
혈구계	앤드윈 사이언티픽	02-671-51B
헤모스탯	정밀 과학 도구	13004-14
헤페스(N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄설폰산)	써모피셔 사이언티픽	15630080
케이클	피셔 케미컬	BP366-500
KH2PO4 (무수)	시그마 알드리치	P5655-100G
액체 질소	에어가스	해당 사항 없음
마우스 FC 블록(CD16/32)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	553141
Na2HPO4 (무수)	피셔 케미컬	S374-500
염화나트륨	피셔 케미컬	S671-500
바늘, 25 게이지	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	305122
노멀 마우스 세럼	써모피셔 사이언티픽	31881
나일론 메쉬 스트레이너	폭스바겐	352350
10월	사쿠라	4583
파라포름알데히드, 20%	전자 현미경 과학	15713-에스	1 x PBS를 사용하여 4%로 희석
파스퇴르 피펫, 9인치, 분리됨	피셔 사이언티픽	13-678-20씨
PBS(1배)	코 닝	21-040-이력서
PE 쥐 안티 마우스 CD4	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	553730
PE-CF594 쥐 안티 마우스 CD19	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	562329
Percoll 밀도 구배 매체	GE 헬스케어	Tel.: 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 쥐 안티 마우스 CD45	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	550994
페트리 접시, 100mm	폭스바겐	353003
pH 측정기	피셔 사이언티픽	13-636-AB150
피펫 에이드	드러먼드 사이언티픽 코퍼레이션	4-000-101
피펫 200 μl	길슨	FA10005M
피펫 팁, 1 mL	미국 과학	1111-2831
피펫 팁, 200 μl	미국 과학	1111-1816
피펫, 1 mL	길슨	FA10006M
DAPI로 다이아몬드 마운턴트 연장	써모피셔 사이언티픽	P36962
정제된 쥐 안티 마우스 CD16/CD32	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	553141
토끼 안티 마우스 CD3 (SP7 클론)	아브캠	AB16669
토끼 안티 마우스 라미닌	아브캠	AB11575
쥐 안티 마우스 ERT-R7	아브캠	AB51824
RPMI 1640	코 닝	10-040-이력서
혈청학적 피펫, 1 mL	폭스바겐	357521
혈청학적 피펫, 10 mL	폭스바겐	357551
혈청학적 피펫, 5 mL	폭스바겐	357543
수산화나트륨	피셔 사이언티픽	시즌 318-100
자당	피셔 케미컬	시즌 5-500
수술용 가위	정밀 과학 도구	14001-16
수술용 가위, 극세	로보즈	RS-5882
주사기, 10 mL	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	302995
주사기, 5mL	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	309646
트리판 블루	지브코	제15250-061

년 명 년 년 년 (영어) 년 년 년 년 년 년 호