측면 소프트 라이트 조명을 사용하여 대뇌 오가노이드 배양을 최적화하는 기술

초록

출처: Chen, B. et al., 측면 연광 조명을 통한 대뇌 오가노이드 배양 촉진.J. Vis. 특급(2022).

이 비디오는 배아의 육안 시각화를 개선하기 위해 측면 소프트 라이트 조명 기술을 활용하여 대뇌 오가노이드 배양 중 배아의 조작 및 전달을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. 소프트 라이트 조명의 설정, 매체 변화 및 배아체 전달 방법, 대뇌 오가노이드 발달을 위한 배아체의 신경 분화를 유도하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 은은한 램프 준비 (1일차)

1. A5 용지 크기의 0.3-0.5cm 두께의 투명 아크릴 보드를 사용하십시오. 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙입니다.
2. 조명이 아크릴 판 측면에서 들어와 병렬로 발사될 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 백색 조명을 한 줄로 설치합니다(그림 1A-F, 그림 2B).
   메모: 초기 EBs의 직경은 약 200μm에서 300μm이기 때문에 깨끗한 벤치의 형광등 아래에서 육안으로 명확하게 관찰하기 어렵습니다. 대조적으로, 확산 반사의 향상으로 인해 측면 조명의 부드러운 빛을 사용하여 EB를 명확하게 감지할 수 있습니다(그림 2B, C). 후속 실험에서 EB 배양에 대해 6웰 플레이트가 권장됩니다. 그러나 부드러운 빛의 시각 효과를 더 잘 보여주기 위해 본 연구에서는 접시 대신 접시를 사용하여 사진이나 비디오를 촬영하는 경우가 있으므로 오해하지 마십시오. 측면 조명이 있는 소프트 라이트 램프는 6웰 플레이트에도 사용할 수 있습니다.

2. EB 이전 및 중간 교체(2-5일차)

1. 새로운 6-well low adhesion plate를 준비하고 각 well에 2mL의 배아체(EB) 형성 배지를 추가합니다.
2. 1000 μL 광구경 피펫 팁이 있는 매체와 함께 EB를 제거하고(재료 표 참조) 6-well 저접착 플레이트(~100 EBs/well)로 옮깁니다.
   메모: 작동 프로세스는 EB를 더 쉽게 관찰할 수 있도록 소프트 라이트 램프(1단계에서 언급)를 채택합니다. 부드러운 조명의 시각 효과를 향상시키기 위해 다른 실내 광원을 끄십시오.
3. 매일 같은 양의 새로운 EB 형성 배지로 교체하십시오. 보조 흐름을 사용하여 EB를 중앙으로 모으고 매체를 변경합니다.
   1. 우물 가장자리로 천천히 피펫팅하여 오래된 배지를 흡입합니다. 너무 세게 빨지 마십시오. 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 매체를 추가하여 EBs.
      를 다시 중단합니다. 메모: 원리 2차 흐름(그림 2D). 접시를 원형 궤도를 따라 회전시켜 소용돌이의 흐름을 유도합니다. 소용돌이 흐름으로 인해 2차 흐름이 유도되고 중심을 향하게 됩니다. EB 또는 오가노이드는 회전을 통해 생성된 2차 흐름으로 인해 유정 중앙으로 수렴하며, 그 후 매체 변화 또는 배아 전달을 쉽게 실행할 수 있습니다.

3. 신경 유도 (5-7 일)

1. 접착력이 낮은 새로운 6-well plate를 준비하고 각 well에 3mL의 신경 유도 배지(표 1)를 추가합니다.
2. 측면 소프트 라이트(1단계에서 언급)를 켜고 다른 실내 광원을 끕니다.
3. EB를 신경 유도 배지(~100 EB/well)가 추가된 6-well 플레이트로 옮깁니다. 새 웰에 원래 매체를 가능한 한 적게 추가합니다.
   메모: 오가노이드 전달의 간단한 기술을 소개합니다. 당연히, 중력 하에서 매질보다 상대적으로 높은 밀도로, 재현탁된 EB는 그림 2E에 나타난 연산을 적용함으로써 서서히 가라앉을 것이다. 따라서 EB를 편리하게 이전할 수 있습니다. EB에 비해 자유 세포와 죽은 세포 단편은 더 천천히 가라앉기 때문에 대부분의 자유 세포와 죽은 세포 단편은 이 침전 방법을 통해 제거할 수 있습니다(그림 2F).
4. 샘플을 37 °C 및 5 % CO₂에서 24 h.
   동안 배양합니다. 메모: 현미경으로 볼 때 EB의 직경은 약 500μm이고 가장자리는 반투명하여 신경 상피층이 형성되었음을 나타냅니다.

표 1. 신경 유도 매체의 구성

구성 요소	음량
DMEM-F12	97 밀리리터
N2 보충제	1 mL
글루타맥스 보충제	1 mL
MEM NEAA	1 mL
덤플링을	최종 농도 1 μg/mL

결과

그림 1: 소프트 라이트 램프의 준비.(A) 전원 공급 장치와 LED 조명은 아크릴 보드의 한쪽 면에 설치되었습니다(빨간색 점선 상자 참조). LED 소프트 라이트 램프의 산란 파장은 450-470nm, 광속은 1300-1800lm, 연색 지수는 75-85 Ra입니다.(B) LED 전구가 정상적으로 점등할 수 있는지 확인했습니다(빨간색 점선 상자 참조). (C) 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙였습니다 (빨간색 화살표로 표시). (D) 부드러운 빛 램프의 전체적인 모양. (E) 소프트 라이트 램프는 프레임이 없는 상업용 LED 페인팅 라이트 패드로 교체할 수도 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2μm 필터	NEST Biotechnology, 중국	331001
1000 μL 광구경 피펫 팁	Thermo Fisher Scientific, 미국	9405163
6-well 낮은 접착 플레이트	NEST Biotechnology, 중국	703011	EB 현탁 배양에 사용됩니다
원심 분리기	Eppendorf, 독일	5810 R	다양한 유형의 원심분리기 튜브, 시약 병 및 작업 플레이트의 원심분리에 사용할 수 있습니다.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, 미국	11330032
덤플링을	Merck, 독일	H3149
글루타맥스 보충제	Thermo Fisher Scientific, 미국	35050061
글루타맥스 보충제	Thermo Fisher Scientific, 미국	17504044
MEM NEAA	Thermo Fisher Scientific, 미국	11140050
N2 보충제	Thermo Fisher Scientific, 미국	17502048
은은한 빛 램프	너트	너트	간단한 자체 제작 장치, 준비를 위해 보충 그림 2를 참조하십시오.

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