배양된 초파리 뇌 외식에서 신경 줄기세포 재활성화 분석

초록

출처: Naomi Keliinui, C., et al. 배양 초파리 뇌 이식에서 신경 줄기 세포 재활성화. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 초파리 뇌 신경 줄기 세포의 정지 상태에서 재활성화를 시작하는 외인성 인자를 식별하는 프로토콜을 보여줍니다. 갓 부화한 유충을 해부하여 뇌를 분리한 다음, 신경 줄기 세포의 재활성화 및 증식을 유도하는 호르몬의 잠재력을 평가하기 위해 테스트 호르몬이 있거나 없는 배지에서 배양합니다.

프로토콜

1. 배양 배지 및 도구 준비

1. 벤치와 작업 영역에 70% 에탄올을 뿌리고 말리십시오.
2. 해부 도구, 집게, 유리 시계 접시 2개에 70% 에탄올을 뿌리고 벤치에서 말리십시오.
3. 보충된 슈나이더 배지(SSM, 표 1)를 만들어 얼음 위에 놓습니다.
4. SSM 1mL를 각 유리 시계 접시에 피펫으로 넣습니다.
5. 멸균 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 PBS 플레이트에서 갓 부화한 유충을 첫 번째 유리 시계 접시의 SSM으로 옮깁니다. 멸균 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 갓 부화한 유충을 두 번째 유리 시계 접시의 SSM으로 옮깁니다.

2. 해부와 뇌 배양

1. 유충이 SSM이 있는 두 번째 유리 시계 접시에 들어가면 집게와 해부 현미경을 사용하여 유충에서 뇌를 해부합니다. 필요에 따라 배율을 조정합니다.
2. 한 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 다른 집게로 몸을 반쯤 잡고 반대 방향(그림 1)으로 당겨 유충을 두 조각으로 나눕니다.
   메모: 뇌는 입 고리 바로 뒤에 위치합니다. 뇌를 둘러싼 다른 조직이 있을 수 있습니다. 이러한 조직을 제거할 때는 뇌가 손상될 수 있으므로 매우 주의하십시오.
3. 15-20개의 뇌를 해부한 후 1mL의 SSM을 멸균 12웰 배양 트레이의 한 웰에 추가합니다. 새로 절부한 뇌를 마이크로피펫과 멸균 팁을 사용하여 SSM으로 옮깁니다(그림 2A).
4. 12웰 배양 트레이의 SSM 배지에 있는 뇌를 25°C의 인큐베이터에서 24시간 동안 넣습니다(그림 2A).

표 1: 슈나이더 배지(SSM)를 보충하기 위한 레시피. 이 표에는 5mL의 SSM을 준비하는 데 필요한 모든 성분의 부피가 나열되어 있습니다.

성분 (시작 농도)	5mL 만들기	최종 집중
슈나이더의 초파리 배지	3.89 밀리리터
소 태아 세럼 (100%)	500 μL<	10%
글루타민 (200 mM)	500 마이크로L	20 밀리미터미터
페니실린(5000 units/mL), 스트렙토마이신(50,000 μg/mL)	100 마이크로L	1000 U/mL 펜, 1 mg/mL 연쇄상구균
인슐린(10mg/mL)	10 μL	0.02 마그네슘 / mL
글루타티온(50mg/mL)	5 μL	0.05 mg/mL
멸균 후드에서 멸균 기술을 사용하여 14mL 원뿔형 튜브에 모든 성분을 함께 추가합니다. 사용할 때까지 얼음 위에 올려 놓으십시오.

결과

그림 1: SSM이 있는 유리 시계 접시에 있는 초파리 유충. 집게는 해부를 위해 적절한 위치에 있습니다. 유충 뇌의 위치(짙은 회색)는 입 고리(검은색)의 뒤쪽에 있으며 둘 다 유충 내부에 표시됩니다.

그림 2 : 뇌 배양 및 면역 염색. (A) SSM 1mL를 함유한 12웰 배양 접시에 담긴 전뇌. 그런 다음 배양 접시를 25°C 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.(B) 72웰 미니 트레이에는 면역염색 중 뇌 이식이 들어 있습니다. 뇌를 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10μL 피펫 팁	덴빌 사이	P2102
1000 μL 피펫 팁	덴빌 사이	P2103-N
1000 μL 피펫터	길슨	P1000
24웰 멀티웰 배양 플레이트	피셔 사이언티픽	전화: 50-197-4477
35mm 페트리 접시	피셔 사이언티픽	08-757-100ᄀ	포도 접시 재료
해부 현미경	자이스	스테미 2000
에탄올 200 프루프(100%), Decon Labs, 1갤런 병	피셔 사이언티픽	2701	배양 배지에서 24시간 유지 전에 유충을 씻어내는 데 사용됩니다
소 태아 세럼 (10%)	시그마	F4135-100ML	세포 배양 배지용 보충제.
해부를 위한 가는 겸자	정밀 과학 도구	11295-20	disections에 사용되는 forcepts. 그들은 날카롭게 할 때 가장 잘 작동합니다.
유리 해부 접시 (3 웰)	더 이상 사용할 수 없습니다.
글루타치온	시그마	G6013	세포 배양 중 산화 보호 기능을 제공합니다.
부 화기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific		실험 전반에 걸쳐 온도, 습도 및 빛 노출이 정확히 동일한지 확인합니다.
인슐린	시그마	I0516 (영어	실험의 독립 변수
층류 후드			부분 표본 배양 배지용
L-글루타민	시그마	G7513	세포 배양 중 지원 제공
펜 스트렙	시그마	P4458-100ml	배양 중 세포의 박테리아 오염을 방지하는 데 사용되는 항생제.
인산염 완충액, pH7.4	집에서 만든	집에서 만든	단계를 수정하고 염색한 후 뇌를 세척하는 데 사용되는 용제
고르다	정밀 과학 도구	10140-01	포도 접시에서 애벌레를 골라내는 데 사용됩니다
슈나이더스 문화 매체	라이프 테크	21720024	세포의 성장과 증식을 돕는 영양소가 함유되어 있습니다.
멸균수	집에서 만든 오토클레이브 Milli-Q 물		솔루션에 필요

(영문) 년 . 년 시리즈 ) ) 년 .