면역자기 비드를 사용한 쥐 1차 희소돌기아교세포 분리

초록

출처: Flores-Obando, R. E. et al., 마우스 1차 희소돌기아교세포의 빠르고 특이적인 면역자기 분리. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 자기 분리를 사용하여 새끼 쥐에서 얻은 신경 세포 현탁액에서 일차 희소돌기아교세포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 희소돌기아교세포 항원에 특이적인 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 이러한 세포를 선택적으로 분리할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 쥐의 뇌 피질 해리

1. 출생 후 5-7일 된 C57Bl/6N 새끼 쥐를 이전에 70% 에탄올로 세척한 가위로 빠르게 참수하여 희생시킵니다.
   메모: 5-6마리의 신생아 생쥐 새끼의 대뇌 피질이 각 준비에 사용되었습니다. 평균적으로 하나의 마우스 뇌는 1-1.5 x 10⁶개의 원발돌기아교세포(Ols)를 산출합니다.
2. 작은 해부 가위로 정중선을 따라 두피 피부를 자르고 집어넣어 두개골을 드러냅니다.
3. 두개골 뒤쪽의 구멍에서 시작하여 정면 쪽으로 정중선을 따라 두개골을 조심스럽게 자르고 뇌가 손상되지 않도록 가위로 들어 올립니다. 그런 다음 두개골 뒤쪽의 구멍을 사용하여 두개골 바닥을 따라 각 눈구멍 쪽으로 자릅니다.
4. 가는 집게를 사용하여 피질을 중뇌에서 부드럽게 떼어내고 7mL의 B27NBMA이 들어 있는 60mm 조직 배양 접시에 옮깁니다. 각 뇌에 대해 2.2단계부터 2.4단계까지 반복하여 절개된 피질을 모읍니다.
5. 5mL의 해리 완충액(B27NBMA, 20-30 U/mL 파파인 및 2,500 U DNase I)을 포함하는 새로운 60mm 조직 배양 접시로 피질을 옮깁니다.
6. #15 메스 블레이드를 사용하여 피질을 약 1mm³의 작은 조각으로 깍둑썰기하고 37°C, 5% 이산화탄소(CO₂) 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다.
7. 효소 반응을 멈추기 위해 소 성장 혈청(BGS) 1mL를 첨가합니다.
8. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 해리 매체와 함께 피질을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
9. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 6-8회 천천히 위아래로 피펫팅하여 기포를 최소화하도록 주의하여 뇌 조직을 부드럽게 해리하기 시작합니다.
10. 조직 덩어리가 2-3분 동안 가라앉을 때까지 기다렸다가 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
11. 조직 펠릿에 10% BGS/2500 U DNase I가 함유된 B27NBMA 3mL를 추가합니다.
12. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 뇌 조직을 부드럽게 해리하면서 위아래로 6-8회 피펫팅합니다. 거품을 최소화하도록 주의하십시오.
13. 조직 덩어리가 2-3분 동안 가라앉을 때까지 기다립니다.
14. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 조직 펠릿에 10% BGS/DNase I을 함유한 B27NBMA 3mL를 추가합니다.
15. P1000 피펫 팁을 사용하여 뇌 조직을 부드럽게 해리하는 동시에 배지와 뇌 조직의 혼합물을 위아래로 피펫팅합니다. 큰 조직 덩어리가 남지 않거나 10% BGS/DNase I을 함유한 B27NBMA이 소진될 때까지 중 먼저 도래하는 시점까지 2.13 및 2.14단계를 반복합니다. 거품을 최소화하도록 주의하십시오.
16. 이전 상등액을 사용한 풀 셀 현탁액.
17. 70μm 세포 여과기를 50mL 튜브에 넣습니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 풀링된 세포 현탁액을 70μm 세포 여과기에 부드럽게 통과시킵니다.
18. 10% BGS/DNase I이 함유된 B27NBMA 1mL를 첨가하여 세포 스트레이너를 세척합니다.
19. 세포 여과기를 폐기합니다. 10% BGS/DNase I을 함유한 B27NBMA로 부피를 30mL로 가져옵니다.
20. 세포 현탁액을 2개의 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 200 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
21. 세포를 공기에 노출시키지 않고 상등액을 제거하십시오. 상등액은 세포 파편으로 인해 흐려집니다. 펠릿에 10% BGS가 포함된 B27NBMA 3mL를 추가합니다.
22. P1000 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 조심스럽게 해리합니다. 10% BGS를 함유한 B27NBMA로 부피를 15mL로 가져옵니다.
23. 새로운 40μm 세포 스트레이너에 세포 현탁액을 통과시킵니다.
24. BGS 10%가 함유된 B27NBMA 1mL를 첨가하여 Cell Strainer를 세척합니다. 세포 여과기를 폐기합니다.
25. 10% BGS를 함유한 B27NBMA로 부피를 30mL로 가져옵니다.
26. 세포 현탁액을 2 x 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 200 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
27. 세포를 공기에 노출시키지 않고 대부분의 상등액을 제거합니다. 세포 펠릿을 5mL의 얼음 저온 자기 세포 분류(MCS) 완충액에 재현탁합니다.

2. 세포 수 및 생존율 결정

1. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 100μL의 세포 현탁액을 400μL의 Trypan Blue 용액으로 희석하여 0.4%(w/v)로 1:5 희석합니다.
2. 혈구계 챔버 위에 커버 유리를 놓고 P10 피펫을 사용하여 두 챔버에 10μL의 세포 희석액을 채우고 과충진을 방지합니다. 용액은 모세관 작용에 의해 커버 유리 아래를 통과합니다.
3. 혈구계를 현미경 스테이지에 놓고 40X 배율을 사용하여 초점을 조정합니다.
   참고: 세포 수는 5개의 사각형(4개의 모서리와 1개의 중앙) 각각에 있는 휴대용 카운터를 사용하여 기록됩니다. 생존 불가능한 세포만 염료를 흡수하여 파란색으로 나타나는 반면, 살아 있고 건강한 세포는 둥글고 굴절되어 보이며 파란색 염료를 흡수하지 않으므로 밀리리터당 생존 가능한 세포와 총 세포의 수를 결정할 수 있습니다.

3. O4⁺ 희소돌기아교세포의 분리

1. 200 x g에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
2. 세포가 공기에 노출되지 않도록 진공 흡인을 사용하여 상등액을 조심스럽게 폐기하십시오.
3. 1 x 10⁷ 총 세포당 90μL의 MCS 완충액에 펠릿을 재현탁한 다음 1 x 10⁷ 세포당 10μL의 항-O4 비드를 추가합니다.
4. 15mL 원뿔형 튜브를 손가락으로 4-5회 가볍게 튕겨 세포 현탁액과 비드를 혼합합니다.
5. 혼합물을 4°C에서 15분 동안 배양하고 5분마다 4-5회씩 손가락으로 15mL 원뿔형 튜브를 튕깁니다.
6. 튜브에 1 x 10⁷ 세포당 2mL의 MCS 완충액을 부드럽게 첨가하여 혼합물을 세척합니다. 혼합물을 200 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
7. 세포가 공기에 노출되지 않도록 진공 흡인을 사용하여 조심스럽게 상등액을 폐기하십시오. 1 x 10⁷ 세포마다 500μL의 MCS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
8. 자기 분리기를 자기 분리기 스탠드에 부착합니다. 선택 컬럼을 자기 분리기에 부착하고 컬럼 위에 40μm 셀 스트레이너를 놓습니다. 분리 컬럼 아래에 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브 2개를 배치하여 플로우 스루(flow through)를 수집합니다.
9. 40μm 세포 스트레이너와 분리 컬럼을 3mL의 MCS 버퍼로 사전 헹구고 버퍼가 건조되지 않고 컬럼을 통과하도록 합니다.
10. 세포 현탁액과 비드의 혼합물을 세포 스트레이너와 선택 컬럼에 추가합니다.
11. 40μm 세포 여과기를 1mL의 MCS 완충액으로 세척합니다.
12. 세포 스트레이너를 버리고 세포, 비드 및 버퍼의 혼합물이 건조되지 않도록 컬럼을 통과하도록 합니다.
13. 분리 컬럼을 MCS 완충액 3mL로 3회, OL 증식 배지로 1회 세척합니다.
14. 자기 분리기에서 분리 컬럼을 제거하고 15mL 코니컬 튜브에 빠르게 넣은 다음 즉시 5mL의 OL 증식 배지를 추가합니다.
15. 컬럼 위에 플런저를 놓고 단단히 밀어 라벨링된 세포를 15mL 코니컬 튜브로 씻어냅니다.
16. 섹션 3.
    에 표시된 대로 Trypan Blue 및 혈구계를 사용하여 세포 수와 생존율을 측정하기 위해 100μL의 세포 현탁액을 제거합니다. 참고: 세포 생존율이 80% 이상이면 OL 배양을 진행할 수 있는 것으로 간주되지만 90% 이상의 생존율이 최적입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10ml 혈청학 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10J
10ml 주사기 Luer-Loc 팁	BD, 벡턴 디킨슨	309604
15ml 원뿔형 튜브	송골매	352097
24웰 조직 배양 플레이트	송골매	353935
40μm 세포 스트레이너	피셔 사이언티픽	22368547
50ml 원뿔형 튜브	송골매	352098
5ml 혈청학적 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10시간
60mm 조직 배양 플레이트	송골매	353002
70μm 세포 스트레이너	피셔 사이언티픽	22363548
Anti-O4 beads- 안티-O4MicroBeads	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-094-543
Autofil 완전한 병 뚜껑 필터 어셈블리, 0.22um 필터, 250ml	미국 과학	6032-1101
Autofil 완전한 병 뚜껑 필터 어셈블리, 0.22um 필터, 250ml	미국 과학	우편번호 6032-1102
B27 보충제	인비트로젠	제17504-044
소 성장 세럼 (BGS)	GE 헬스케어 생명과학	SH30541.03
증권 시세	피셔 사이언티픽	BP-1600-100
증권 시세	페프로텍	450-50
데옥시리보뉴클레아제 I (DNAse I)	워 딩 턴	LS002007
에디타	피셔 사이언티픽	시즌 311
깃털 일회용 메스	앤드윈 사이언티픽	EF7281C
포도당	피셔 사이언티픽	라16-1
글루타맥스	인비트로젠	35050-61
인슐린	인비트로젠	제12585-014
마그네틱 세퍼레이터 스탠드 - MACS multistand	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-303
자기 분리기 - MiniMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-302
Millex PES 0.22μm 필터 유닛	밀리포어	SLG033RS
신경기저 매체 A	인비트로젠	제10888-022
파파인	워 딩 턴	LS003126
Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS	시그마	D5652
DNase I 재고 솔루션			1. 12,500U Deoxyribonuclease I/ml에서 얼음에 식힌 HBSS에 녹입니다. 2. 여과기는 ice 에 살균합니다 3. 200 μl에 부분 표본을 만들고 -20°C. 에 밤새 동결하십시오 4. 부분 표본을 -20에서 -30°C에 보관하십시오.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)			파우치를 물 1리터에 녹이면 배지 1리터당 분말 9.6g이 함유된 배지 1리터가 생성됩니다. 2-8 °C에서 보관하십시오.
Trypan 블루 솔루션	코 닝	25-900-CI
B27NBMA			487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 보충제; 1 mL 프리모신; 1.25 mL 글루타맥스; 필터는 멸균하고 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL 소 성장 세럼
CNTF 용액 스톡(10μg/ml, 1000X)			Peprotech에서 주문하십시오 (450-50). 제조업체의 지침에 따라 완충액(예: DPBS + 0.2% BSA)에 0.1-1mg/ml(로트마다 다를 수 있음)로 구성합니다. -80 °C에서 보관하십시오. 작업 용액 (10 μg/ml, 1000X) 1. DPBS 용액에서 0.2% BSA (Fisher Scientific BP-1600-100)를 만들고 sterilize. 필터링합니다. 2. 마스터 스톡 부분 표본을 10μg / ml로 희석하고 멸균 된 0.2 % BSA / DPBS. 3. 부분 표본 (20μl/tube) 및 황급한 액체 nitrogen. 에 있는 동결 4. 부분 표본은 -80 °C에서 보관하십시오.
자기 세포 분류(MCS) 버퍼			인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.5mM EDTA, 5μg/ml 인슐린, 1g/L 포도당을 포함하는 용액을 준비합니다. 0.22μm Millex 필터를 통과시켜 버퍼를 여과하여 살균 및 탈기합니다. 사용할 때까지 버퍼를 4°C에서 보관하십시오.
행크스 밸런스 솔트 (HBSS) (시그마			1. 실린더에 물 900ml(온도 15-20°C)를 넣고 부드럽게 저어줍니다. 2. 힘을 넣고 녹을 때까지 저어줍니다. 3. 소량의 물로 원래 패키지를 헹구어 powder. 의 모든 흔적을 제거하십시오. 4. 2. 단계에서 솔루션에 추가합니다. 5. 최종 부피 1 리터에 대해 0.35 gr의 중탄산 나트륨 (7.5 % w / v)을 추가합니다 . 6. 녹을 때까지 계속 저어줍니다. 7. 여과 중에 상승할 수 있으므로 pH= 7.4 미만의 0.1-0.3 단위로 교반하면서 버퍼의 pH를 조정합니다. pH. 를 조정하려면 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용하는 것이 좋습니다. 8. 물을 더 추가하여 최종 부피를 1L. 로 만듭니다. 9. 0.22 미크론의 다공성을 가진 막을 사용하여 여과에 의하여 살균하십시오. 10. 2-8 °C에 보관하십시오.