Schwann 세포 표현형 연구를 위한 마이크로패턴 기질의 준비

초록

출처: Xu, Z., Orkwis, et al. 슈반 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 조정 가능한 세포 외 매트릭스 미세환경 준비. J. Vis. 특급. (2020).

이 비디오는 세포 표현형 사양을 연구하기 위한 마이크로패턴 기질의 준비에 대해 설명합니다. 단백질 코팅된 마이크로패턴 PDMS 스탬프는 PDMS 코팅된 커버슬립에서 마이크로패턴을 전송하는 데 사용됩니다. 그런 다음 커버슬립을 계면활성제로 처리하여 원치 않는 표면에서 세포 부착을 방지합니다. 그런 다음 세포를 추가하여 패턴에 정착시키고 추가 분석을 위해 배양합니다.

프로토콜

1. 조정 가능한 세포 배양 기질 준비 및 특성화

1. 기판 준비
   1. 피펫 팁을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 엘라스토머와 경화제를 혼합물 내에서 기포가 균일하게 분산될 때까지 10:1 및 60:1 사이의 비율로 격렬하게 혼합합니다. 거품이 소멸될 때까지 진공 건조를 사용하여 기포를 제거합니다.
      참고: PDMS 중합 중에 경화제는 베이스 엘라스토머와 가교하여 최종 폴리머의 원하는 기계적 특성을 제공합니다. PDMS 강성을 변경하기 위해 가교 비율을 조정할 수 있습니다.
   2. 건조된 PDMS 혼합물 한 방울(~0.2mL)을 정사각형 또는 원형 커버슬립(예: 22mm x 22mm)에 놓고 스핀 코터에서 커버슬립을 2500rpm으로 30초 동안 회전합니다.
   3. 커버슬립을 60°C의 오븐에서 1-2시간 동안 또는 실온에서 하룻밤 동안 배양하여 PDMS가 응고되도록 합니다.
   4. UV-오존 클리너를 사용하여 커버슬립을 7분(UV 파장: 185nm 및 254nm) 동안 처리하여 표면 친수성을 높입니다. 멸균된 6웰 플레이트에 넣습니다.
   5. 세포 배양에 사용하기 전에 기질을 70% 에탄올에서 최소 30분 동안 배양하십시오.
      주의 : UV-오존 클리너는 인체에 유해한 오존을 생성할 수 있습니다. 화학 흄 후드 또는 어떤 형태의 환기 장치에서 작업하십시오.
2. 마이크로패터닝된 기판 준비
   1. CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 원하는 형상 및 셀 접착 영역(900μm², 1,600μm² 및 2,500μm²)을 그립니다. 상업용 공급업체의 이러한 패턴을 기반으로 크롬 포토마스크를 만듭니다.
   2. 클린룸 또는 먼지가 없는 환경에서 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 제조하십시오. 이 특정한 신청을 위한 긴요한 매개변수는 다음과 같이 입니다: 감광저항액: SU-8 2010년; 포토레지스트를 분산시키기 위한 스핀 프로파일: 100rpm/s의 가속도로 10초 동안 500rpm, 300rpm/s의 가속도로 30초 동안 3500rpm; 자외선의 노출 에너지 : 130 mJ / cm2.
      참고: 실리콘 웨이퍼의 패턴 높이는 이러한 매개변수를 따라 약 10μm입니다. 직사각형 또는 삼각형 패턴 바깥쪽의 가장자리 주변의 잠재적인 균열은 1.2.2단계 후에 광학 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다. 실리콘 웨이퍼를 190°C에서 30분 동안 굽는 것은 균열을 제거하는 데 도움이 됩니다.
   3. 패턴화된 실리콘 웨이퍼를 직경 150mm x 높이 15mm의 원형 페트리 접시 내부에 놓고 1.1.1단계에서 준비한 대로 탈가스된 PDMS(혼합 비율 10:1)를 실리콘 웨이퍼에 붓습니다.
      참고: 마이크로 접촉 인쇄 단계에서 쉽게 취급할 수 있도록 PDMS의 두께가 5mm 이상인지 확인하십시오.
   4. 하룻밤 동안 60°C의 오븐에서 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 응고시킵니다. PDMS를 실온으로 식히십시오. 수술용 메스를 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 올바른 패턴이 포함된 30mm x 30mm 정사각형 스탬프를 정밀하게 절단합니다. 실리콘 웨이퍼를 손상시키지 마십시오.
      참고: 실리콘 웨이퍼는 이소프로판올로 세척한 후 더 많은 스탬프를 생성하기 위해 이 시점에서 여러 번 재사용할 수 있습니다.
   5. PDMS 스탬프와 조정 가능한 커버슬립(1.1.1 - 1.1.3 단계로 준비)을 70% 에탄올에 30분 동안 담가 멸균합니다.
   6. 마이크로 컨택트 인쇄 후 PDMS 스탬프에 의한 마이크로패턴의 효능을 확인하려면 여과된 공기 흐름과 피펫 50μg/mL 소 혈청 알부민(BSA)(Texas Red conjugated) 용액을 사용하여 PDMS 스탬프의 표면을 건조시켜 PDMS 스탬프의 패턴이 있는 면 전체를 덮습니다.
   7. 단백질 흡착을 위해 실온에서 1시간 동안 BSA 용액으로 PDMS 스탬프를 배양합니다.
   8. 여과된 공기 흐름을 사용하여 조정 가능한 커버슬립의 표면을 건조시키고 1.1.5단계에 설명된 대로 표면 친수성을 높입니다.
   9. PDMS 스탬프를 자연 건조하여 남아 있는 BSA 용액을 제거합니다.
      참고: 남아 있는 용액으로 인해 미세 접촉 인쇄 중에 스탬프가 커버슬립에서 미끄러질 수 있으므로 BSA 용액이 스탬프에서 완전히 제거되었는지 확인하십시오.
   10. 스탬프의 패턴화된 면을 커버슬립 표면의 BSA 흡착을 위해 조정 가능한 커버슬립과 등각 접촉으로 가져옵니다. 스탬프를 커버 슬립에 대고 5분 동안 부드럽게 누릅니다.
       참고: 스탬프가 구부러져 스탬프와 커버슬립 사이에 불특정 접촉을 유발할 수 있으므로 스탬프에 과도한 힘을 가하지 마십시오. 스탬프에 가해지는 적절한 힘의 양은 성공적인 마이크로 접촉 인쇄에 필수적입니다.
   11. FITC(Fluorescein isothiocyanate) 필터가 있는 형광 현미경을 사용하여 마이크로패턴을 검사합니다.
   12. 형광 패턴이 아닌 세포 접착 영역을 인쇄하려면 BSA 단백질 대신 라미닌을 사용하고 1.2.5에서 1.2.10 단계를 반복합니다.
   13. 커버슬립에서 스탬프를 제거하고 커버슬립을 멸균된 6웰 플레이트에 옮깁니다. 각 웰에 0.2% w/v Pluronic F-127 용액 2mL를 추가하여 커버슬립 표면을 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
       참고: Pluronic F-127은 PDMS 표면에 흡착되어 PDMS 표면의 소수성을 증가시켜 세포의 접착을 차단할 수 있습니다.
   14. Pluronic F-127 용액을 흡인하고 세포를 파종하기 전에 인산염 완충액 식염수(PBS)로 5배, 세포 배양 배지로 1배로 세척합니다. SC의 일반적인 시딩 밀도는 1,000셀/^cm2입니다.
   15. 세포 파종 후 45분 후에 세포 배양 배지를 제거하고 PBS 2x로 커버슬립을 세척하여 여러 SC가 동일한 패턴을 고수하는 것을 방지합니다. 정량화 전 48시간 동안 원하는 세포 배양 환경에서 세포를 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청(BSA)의 알부민, 텍사스 레드 접합체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A23017	미세패턴을 보여주기 위한 BSA 염색
둘베코의 변형된 독수리 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11965092	세포 배양 배지
소 태아 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	16000044	세포 배양 배지 보충
피브로넥틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제33010-018	커버슬립을 코팅하는 데 사용되는 단백질
형광 현미경	니콘	이클립스 Ti2	형광 현미경
라미닌	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	23017015	커버슬립을 코팅하는 데 사용되는 단백질
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	세포 배양 배지 보충
플루로닉 F-127	시그마 알드리치	P-2443	비특이적 단백질 결합 차단
SYLGARD 184 PDMS 베이스 및 경화제	시그마 알드리치	761036	커버슬립을 코팅하는 데 사용되는 조정 가능한 폴리머
UV-오존 클리너	노바스캔		PDMS의 친수성 향상