쥐 척추근에서 Schwann 세포의 분리

초록

출처: He, Q., et al., & Ding, F. 체외에서 감각 및 운동 신경의 섬유아세포 및 슈반 세포 정화. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 쥐의 척추 뿌리에서 슈반 세포의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 그런 다음 분리된 세포를 특정 배지에서 배양합니다. 슈반(Schwann) 세포는 차등 분해(differential digestion) 및 부착(adélection)을 통해 분리됩니다. 그 후 부착 및 증식을 위해 세포외 기질로 코팅된 커버슬립으로 전달됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 운동 및 감각 신경 섬유 아세포와 SC (슈반 세포)의 분리 및 배양

1. 중국 난퉁 대학의 실험 동물 센터의 7일 된 Sprague-Dawley(SD) 쥐(n=4)를 사용합니다. 쥐를 5% 이소플루란이 들어있는 탱크에 2-3분 동안 넣고 동물이 천천히 숨을 쉬고 독립적인 활동을 하지 않도록 한 다음 참수 전에 75% 에탄올을 사용하여 소독합니다.
2. 가위를 사용하여 뒷피부를 3cm 정도 자르고 척추를 제거합니다. 척수를 노출시키기 위해 척추관을 조심스럽게 엽니다.
3. 60mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 D-Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 2-3mL를 넣고 척수를 유지합니다.
4. 해부학적 구조에 따라 해부 현미경으로 복부근(운동 신경)을 절제하고 등뿌리(감각 신경)를 절제합니다. 다음으로 얼음처럼 차가운 D-Hanks의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 넣습니다.
5. HBSS를 제거한 후 가위로 신경을 3-5mm 조각으로 자르고 37°C에서 18-20분 동안 0.25%(w/v) 트립신 1mL로 소화합니다. 다음으로, 소화를 멈추기 위해 10% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 DMEM 3-4mL를 보충합니다.
6. 혼합물을 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하고 800 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 버리고 10% FBS가 보충된 DMEM 2-3mL에 침전물을 현탁시킵니다.
7. 400 메쉬 필터를 사용하여 세포 현탁액을 여과한 다음 60mm 페트리 접시에 세포를 접종하고 37°C에서 5% CO2로 배양합니다. 배양 4-5일 후, 90% 합류점에 도달한 후 계대 0(p0) 섬유아세포와 SC를 분리합니다.
8. SC의 분리 및 배양(그림 1)
   1. 1x PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 60mm 페트리 접시당 0.25%(w/v) 트립신(37°C) 1mL를 추가하여 실온에서 8-10초 동안 세포를 소화합니다. 그 후, 10% FBS가 보충된 DMEM 3mL를 첨가하여 소화를 중단시켰습니다.
   2. 피펫으로 혼합물을 부드럽게 불어 SC를 분리합니다. 그런 다음 5분 동안 800 x g에서 SC를 수집하고 원심분리합니다.
   3. 상등액을 버리고 DMEM 3mL에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2μM 포스콜린 및 10ng/mL HRG로 잔류물을 현탁시킨 다음 코팅되지 않은 60mm 페트리 접시에 세포를 접종합니다. 37 ° C에서 30-45 분 동안 배양 한 후 섬유 아세포(일부 섬유 아세포는 SC로 소화됨)가 접시 바닥에 부착됩니다.
   4. 상층액(SC 포함)을 다른 폴리-L-라이신(PLL)으로 옮기고 코팅된 배지 접시와 배양물을 37°C에서 2일 동안 배양합니다.

결과

그림 1 : 감각 및 운동 섬유아세포와 SC의 분리 및 정화 단계를 보여주는 개략도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
D-Hank의 균형 잡힌 소금 용액	지브코	14170112
DMEM을 참조하십시오.	코 닝	10-013-이력서
해부 현미경	올림푸스	SZ2-ILST
소 태아 혈청(FBS)	지브코	10099-141씨
포스콜린	시그마	F6886-10MG
0.25%(w/v) 트립신	지브코	제25200-072
문화 요리
원심분리기 튜브
커버슬립
폴리-L-라이신
CO2 인큐베이터

호