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1. 투과성 지지 삽입물에서 마우스 내피 배양 준비
참고: BEND3 셀은 제조업체의 지침에 따라 유지됩니다.
- 500mL의 DMEM에 FBS 50mL와 페니실린-스트렙토마이신 5mL를 첨가하고 잘 혼합하여 BEND3 세포 배지(BM)를 준비합니다.
- 접시에서 배지를 흡인하고 BEND3 세포 배양액을 PBS 1mL로 한 번 세척합니다. 0.25% 트립신-EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산) 1mL를 세포에 첨가하고 37°C에서 4분 동안 배양합니다.
- 세포에 BM 1mL를 첨가하여 트립신-EDTA를 중화하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 완전히 해리시킵니다. 세포 현탁액을 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 400 x g에서 5분 동안 실온(RT)에서 원심분리하여 펠렛화합니다.
- 튜브에서 상등액을 흡인하고 9mL의 새로운 BM으로 세포를 재현탁시킨 다음 1mL의 세포 현탁액을 하나의 투과성 지지 삽입체에 추가합니다. 매트릭스의 하단 챔버에 웰당 2mL의 새 BM을 더 추가합니다. 하루 동안 세포를 계속 배양합니다.
2. 신경-내피 공동 배양 및 Ac4ManNAz 라벨링 시스템 구축
- 어느 날, 인서트에 BEND3 셀을 도금한 후 먼저 하단 챔버의 매체를 부드럽게 흡인한 다음 인서트를 흡입합니다. 예열된 DMEM(Dulbecco의 변형된 독수리 매체)으로 인서트의 인페이스를 3회 세척합니다. 예열된 DMEM으로 헹궈 인서트의 외부 표면을 세척합니다.
- 1mL의 예열된 AM(부착 배지)을 하나의 삽입물에 추가한 다음 삽입물을 일차 피질 세포가 있는 웰로 옮깁니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 12 시간 동안 공동 배양을 배양합니다.
- Ac4ManNAz를 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 용해시켜 200mM의 스톡 농도를 달성합니다.신경-내피 공동 배양을 설정한 후 12시간 후에 하단 챔버당 1μL의 Ac4ManNAz 스톡과 인서트당 0.5μL의 스톡을 공동 배양에 추가합니다. 접시를 즉시 부드럽게 흔들어 매체를 잘 섞습니다. 제어 셀의 경우 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 5 일 동안 세포를 더 배양합니다. 10x bFGF를 재공급 매체(RM)로 사용하여 AM을 준비합니다. 이 기간 동안 인서트당 100μL의 RM과 하단 챔버당 200μL의 RM을 추가하여 격일로 내피 및 신경 세포에 재공급합니다. 재공급하는 동안 배양액에 Ac4ManNAz 또는 DMSO를 공급하지 마십시오.