Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles(쥐 실질 세동맥에서 대뇌 내피관 준비)

초록

출처: Hakim, M. A., et al., 마우스 뇌 실질의 세동맥 내피의 분리 및 기능 분석. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 쥐의 대뇌 실질에서 내피관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 효소 분해와 기계적 해리의 조합을 통해 이 과정은 내피 세포가 있는 온전한 튜브를 생성합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 용액 및 약물

1. 생리학적 염 용액(PSS)
   1. 140mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂, 10mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 및 10mM 포도당을 사용하여 최소 1L의 PSS를 준비합니다.
   2. 대뇌 세동맥 박리 및 내피관 분리를 위해 CaCl₂(zero Ca²⁺ PSS)가 없는 용액을 준비합니다.
      메모: 초순수 탈이온화 H2O로 모든 용액을 준비한 다음 여과(0.22μm)합니다. 최종 제품에 삼투압이 290에서 300mOsm 사이인 pH 7.4가 포함되어 있는지 확인합니다.
2. 소 혈청 알부민 (BSA, 10%)
   1. 동결건조된 BSA 분말 1g을 zero Ca²⁺ PSS 10mL의 비커에 녹입니다. 비커를 덮고 BSA가 용해될 때까지 천천히 저어주면서 최소 2시간 동안 기다립니다.
   2. 10mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 여과하고 -20°C에서 보관할 1mL 부분 표본을 준비합니다.
3. 해부 솔루션
   1. 500 μL의 BSA(10%)를 49.5 mL의 zero Ca²⁺ PSS에 추가하여 총 50 mL의 부피를 만듭니다.
   2. 세동맥 박리를 위해 용액을 페트리 접시로 옮깁니다.
4. 해리 솔루션
   1. 5 μL의 CaCl₂ 용액(1 M)과 500 μL의 BSA(10%)를 49.5 mL의 zero Ca²⁺ PSS에 추가하여 총 부피 50 mL를 만듭니다. 용액을 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
5. 효소
   1. 파파인 100μg/mL, 디티오에리스리톨 170μg/mL, 콜라겐분해효소 250μg/mL(H형 혼합물) 및 엘라스타제 40μg/mL가 포함된 소화 용액 1mL를 준비합니다.
      메모: 효소 활성은 다양할 수 있지만, 성공적인 프로토콜에는 다음과 같은 효소 활성이 필요할 수 있습니다: 파파인의 경우 ≥ 10 units/mg, 콜라겐 분해 효소의 경우 ≥ 1 unit/mg, 엘라스타제의 경우 ≥ 5 units/mg.
       

2. 실질 세동맥의 격리

참고: 중대뇌동맥(MCA)에서 발생하고 뇌 실질에 내장된 세동맥이 이 프로토콜에 대해 선택됩니다. 세동맥은 앞서 설명한 바와 같이 11 변형과 함께 격리됩니다.

1. 강철 핀(직경: 0.2mm, 길이: 11-12mm)을 사용하여 숯이 주입된 실리콘 폴리머 코팅(깊이 ≥ 50cm)이 포함된 페트리 접시의 냉간 해부 용액에 격리된 뇌를 고정합니다.
2. 날카롭고 정렬된 해부 가위를 사용하여 MCA 주위로 뇌 조직의 직사각형(길이: 5mm, 너비: 3mm)을 자르면서 조직 분절의 윗부분이 Circle of Willis의 분기점을 지나도록 합니다. 필요한 경우 더 많은 세동맥에 접근하기 위해 뇌의 다른 반구에서 다른 직사각형의 뇌 조직을 잘라냅니다.
3. 강철 핀(직경: 0.1mm, 길이: 13-14mm)을 사용하여 MCA가 위쪽(Circle of Willis에서 원위)을 향하도록 분리된 뇌 조직 분절을 접시에 고정합니다. 핀 근처를 조심스럽게 얕게 절개하여 작은 집게로 피아를 제거하고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 벗겨냅니다(그림 1C). 필요한 경우 더 많은 세동맥에 접근하기 위해 다른 조직 분절에서 pia를 제거합니다. 핀으로 접시의 MCA에서 분기된 실질 세동맥이 있는 분리된 피아를 조심스럽게 고정하고 실질 세동맥을 절개하여(그림 1D) 세동맥이 손상되지 않았는지 확인합니다.
   메모: 실질에서 피아로 세동맥을 쉽게 뽑아내지 못하면 가는 집게를 사용하여 윌리스 서클의 MCA 분기점부터 시작하여 뇌를 파냅니다. 세동맥을 찾고, 세동맥 주위의 조직을 조심스럽게 느슨하게 하고(그림 1E), 세동맥의 위쪽 끝을 잡고 실질에서 세동맥을 부드럽게 당겨 빼냅니다(그림 1F). 여러 개의 세동맥(길이: ~1.5-2mm)을 하나의 직사각형의 뇌 조직에서 분리할 수 있습니다.
4. 세동맥이 조직이 부착되지 않고 깨끗한지 확인하고 남아 있는 원위 가지를 잘라냅니다(그림 2A). 효소 소화를 위해 이 깨끗하고 손상되지 않은 세동맥을 사용하십시오. 또는 원하는 경우 내피관 준비를 위한 효소 분해를 위해 각 세동맥을 두 조각(길이: 0.75-1mm)으로 자릅니다.
    

3. 실질 세동맥의 소화 및 내피관의 준비

1. 장비 및 피펫 배치
   메모: 뇌에서 동맥 내피관을 분리하는 것은 이전에 설명되었습니다13,18. 현재 프로토콜은 실질(뇌내) 세동맥에서 내피를 분리하기 위한 수정 사항을 통합합니다. 여러 세동맥 또는/및 세동맥 조각을 효소 분해를 위해 함께 사용할 수 있습니다.
   1. 챔버와 미세 조작기를 지지하는 알루미늄 스테이지를 사용하여 내피 튜브를 준비하기 위한 분쇄 장치13를 조립합니다. 대물렌즈(5x-60x)가 장착된 현미경과 컴퓨터 모니터에 연결된 카메라를 조립합니다. 펌프 컨트롤러가 있는 마이크로 주사기를 스테이지와 표본 옆에 고정합니다.
   2. 마이크로 주사기 피스톤 위에 미네랄 오일로 다시 채워진 trituration 피펫을 고정합니다. 펌프 컨트롤러와 함께 마이크로 주사기를 사용하여 피펫에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 미네랄 오일 상단의 trituration 피펫(~130nL)으로 해리 용액을 빼냅니다.
2. 세동맥 분절의 부분 소화
   1. 100μg/mL 파파인, 170μg/mL 디티오에리스리톨, 250μg/mL 콜라겐분해효소 및 40μg/mL 엘라스타아제가 들어 있는 10mL 유리관에 있는 1mL의 해리 용액에 온전한 세동맥 분절을 놓습니다. 세동맥 분절을 34°C에서 10-12분 동안 배양합니다.
   2. 분해 후 효소 용액을 실온에서 3-4mL의 새 해리 용액으로 교체하십시오.
3. 세동맥 내피관의 분리
   참고: 효소 용액의 분해 및 교체 후, 하나 또는 여러 개의 부분적으로 분해된 세그먼트를 이동식 플랫폼에 부착된 초융합 챔버의 해리 용액으로 전달합니다. 100배에서 200배 배율로 보는 동안 부분적으로 분해되었지만 끊어지지 않은 혈관 세그먼트 하나를 선택하고 현미경으로 초점을 맞춥니다.
   1. 마이크로주사기 주입기에 부착된 trituration 피펫을 챔버의 해리 용액에 놓고 분해된 vessel segment의 한쪽 끝 가까이에 배치합니다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 1-3nL/s 범위 내에서 속도를 설정합니다.
   2. 100x - 200x 배율을 유지하면서 세동맥 분절을 피펫으로 빼낸 다음 배출하여 외막 및 평활근 세포를 분리합니다(그림 1B). 모든 평활근 세포가 해리되고 내피 세포만 온전한 "관"으로 남을 때까지 혈관 분절을 분쇄합니다.
      메모: trituration 중 필요한 경우 끝이 가는 집게를 조심스럽게 사용하여 내피관에서 해리된 외막과 내부 탄성 층을 제거합니다. 일반적으로 몇 번의 trituration 주기만이 온전한 내피관을 생성합니다.
   3. micromanipulator를 사용하여 붕규산 유리 피펫으로 챔버의 유리 커버슬립에 내피 튜브의 각 끝을 고정합니다(그림 2C, D).
4. 세동맥 내피관 고정
   1. 해리 용액을 과융합 용액(2mM CaCl₂를 함유하는 PSS)으로 교체하면서 비내피 물질이 챔버에서 씻겨 나갔는지 확인합니다.
   2. 이동식 플랫폼의 안전한 내피관을 연속 과융합 및 세포 내 또는 형광 기록/이미징을 위해 설계된 현미경 장비로 옮깁니다.
   3. 실험 중에 PSS의 지속적인 전달을 적용합니다. 층류와 일치하는 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 유속(5-7mL/분)을 수동으로 설정하는 동시에 용액 흐름의 공급을 진공 흡입 정도에 맞춥니다. 백그라운드 데이터 및/또는 염료 로딩을 획득하기 전에 내피관의 과융합을 위해 챔버로 ≥5분의 PSS 흐름을 허용합니다.

결과

그림 1: 실질 세동맥의 해부 및 분리. (A) 온전한 Circle of Willis를 가진 고립된 쥐의 뇌. (B) MCA를 포함하는 절개된 직사각형 뇌 조직 조각(흰색 화살표). (C) 조직의 상부(동맥, 파란색 화살표)에서 pia의 분리. (D) 중대뇌동맥(노란색 화살표)에 연결된 세동맥(파란색 화살표로 윤곽선이 그려진 세동맥). (E) 뇌 조직에서 확인된 세동맥(파란색 화살표). (F) 느슨해진 조직에서 세동맥(파란색 화살표)을 뽑아냅니다. 패널 E와 F는 세동맥을 분리하기 위한 대체 방법을 나타냅니다(프로토콜 단계 3.2.3 참조). 스케일 바 = 2mm(A,B,C), 0.2mm(D) 및 1mm(E,F).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
수조 냉각기 (Isotemp 500LCU)	써모피셔 사이언티픽	13874647
붕규산 유리 모세관 (Pinning)	워너 인스트루먼트	G150T-6
붕규산 유리 모세관(날카로운 전극)	워너 인스트루먼트	GC100F-10
붕규산 유리 모세관 (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), 미국 플로리다주 새러소타	AN-번호 1B100-4
BSA: 소 혈청 알부민	시그마	A7906
CaCl2 : 염화칼슘	시그마	223506
콜라겐 분해 효소 (H형 블렌드)	시그마	C8051
데이터 수집 디지타이저	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	디지데이터 1550A
해부 접시 (숯불 실가드 바닥이 있는 유리 페트리)	Living Systems Instrumentation, 미국 버몬트주 세인트알반스시티	DD-90-S-BLK(블랙)
디티오에리스리톨	시그마	D8255
DMSO: 디메틸 설폭사이드	시그마	D8418
엘라스타아제(돼지 췌장)	시그마	E7885
유량 조절 밸브	워너 인스트루먼트	FR-50
형광 시스템 인터페이스, ARC 램프 및 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치 및 PMT	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	IonOptix 시스템
겸자(끝이 가늘고 날카롭게)	증권 시세	뒤몽 #5 & 뒤몽 #55
포도당	Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)	G7021
HEPES : (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)	시그마	H4034
KCl: 염화칼륨	시그마	P9541
MgCl2 : 염화 마그네슘	시그마	M2670
마이크로 매니퓰레이터	시스키유	MX10
마이크로 피펫 풀러(디지털)	Sutter Instruments, 미국 캘리포니아주 노바토	P-97 또는 P-1000
현미경(Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, 미국 뉴욕주 멜빌	TSS2
현미경(Nikon-inverted)	니콘 인스트루먼트 Inc	이클립스 TS100
현미경 스테이지(알루미늄)	Siskiyou, 그랜트 패스, 오리건, 미국	8090피
마이크로 주사기 펌프 컨트롤러	World Precision Instruments (WPI), 미국 플로리다주 새러소타	SYS-마이크로4
NaCl : 염화나트륨	시그마	S7653
파파인	시그마	P4762
위상차 목표	니콘 인스트루먼트 Inc	(Ph1 DL, 10X 및 20X)
가위 (3mm 및 7mm 블레이드)	Fine Science Tools(또는 FST), 포스터 시티, 캘리포니아, 미국	모리아 MC52 & 15000-00
가위(Vannas 스타일, 9.5mm 및 3mm 블레이드)	세계적인 정밀 기기	555640초, 14364
온도 컨트롤러(듀얼 채널)	워너 인스트루먼트	TC-344B 또는 C
밸브 제어 시스템	워너 인스트루먼트	VC-6

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