조기 추간판 질환을 시뮬레이션하기 위한 전염증성 장기 배양 모델 생성

초록

출처: Saravi, B., et al. 초기 단계의 추간판 질환을 시뮬레이션하기 위한 전염증성, 퇴행성 장기 배양 모델. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 3차원 장기 배양 모델을 개발하기 위해 생물반응기에서 소 추간판을 배양하는 기술을 보여줍니다. 특정 영양 결핍 배지 및 퇴행성 압력 조건이 디스크에 적용되어 초기 단계의 추간판 질환에서 관찰되는 전염증성 및 퇴행성 미세환경을 모방합니다. 디스크 높이는 영양 결핍 및 퇴행성 부하의 영향을 분석하기 위해 처리 후 측정됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 소 추간판 해부

1. 꼬리 전체를 수돗물로 철저히 헹구어 표면의 먼지와 머리카락을 제거합니다.
   메모: 원위 말단이 손상되지 않은 상태에서 원하는 IVD 크기에 따라 꼬리당 최대 9개의 추간판(IVD)(미골 1-9)을 실험에 사용할 수 있습니다. 15-20mm 사이의 원하는 직경을 고려하여 실험을 위해 꼬리당 5개의 IVD가 있는 12개의 소 꼬리를 사용했습니다.
2. 1% 베타딘 용액이 들어 있는 상자에 꼬리 전체를 10분 동안 담그고 멸균 거즈로 꼬리를 간단히 말리고 멸균 커튼에 놓습니다.
   메모: 디스크를 해부하는 동안 탈수를 방지하기 위해 Ringer의 용액 습식 거즈로 꼬리를 가습합니다. 전체 해부 절차가 완료될 때까지 젖은 거즈로 싸인 꼬리(또는 남은 부분)를 보관하십시오.
3. 메스(20번)를 사용하여 꼬리 척추에서 연조직을 최대한 완전히 제거하여 IVD를 쉽게 식별할 수 있습니다. 뼈 제거 플라이어로 척추뼈의 가시 및 횡돌기를 제거합니다.
   메모: 원하는 직경의 IVD를 선택합니다. 본 연구에서는 직경 범위가 15-20mm인 IVD가 사용되었습니다.
4. 뼈 펜치로 각 척추체의 중앙을 가로로 잘라 개별 동작 세그먼트를 얻습니다. Ringer의 용액으로 거즈를 적신 페트리 접시에 모션 세그먼트를 넣습니다.
5. 촉진을 통해 IVD와 척추를 찾고 운동 세그먼트를 부드럽게 움직입니다. IVD의 성장판에 있는 띠톱으로 IVD의 각 측면에 하나씩 두 개의 평행 절단을 만듭니다. IVD에서 척추뼈를 향해 약 0.5-1mm의 안전 거리로 디스크(연질)에 인접한 뼈 종판 부분(단단함)의 볼록한 부위를 만지고 찾아 성장판의 위치를 확인합니다. 척추를 절단하는 동안 띠톱의 날이 Ringer의 용액으로 냉각되었는지 확인하십시오.
6. Ringer의 용액으로 적신 깨끗한 거즈로 깨끗한 페트리 접시에 IVD를 옮깁니다.
   메모: 거즈는 IVD의 부종을 방지하기 위해 촉촉하고 너무 젖지 않아야 합니다.
7. 메스 날을 사용하여 척추 몸체 (빨간색 / 분홍색 뼈), 성장판 (흰색 연골)을 긁어 내고 종판은 그대로 둡니다 (노란색-분홍색). 로딩 절차를 위해 두 표면을 평평하고 평행하게 만듭니다. 긁어낸 IVD를 Ringer의 솔루션으로 적신 거즈로 새 페트리 접시에 옮깁니다.
   메모: IVD를 잡고 긁는 동안 손을 보호하기 위해 체인 장갑을 착용하십시오.
8. 캘리퍼로 디스크 높이와 직경을 측정합니다. 제트 세척 시스템을 사용하여 Ringer's solution으로 척추뼈의 혈전을 청소합니다.
9. IVD를 튜브당 하나의 IVD인 50mL 플라스틱 튜브로 옮깁니다. IVD당 인산염 완충 식염수(PBS) 25mL + 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 10%를 넣고 실온의 오비탈 쉐이커에서 15분 동안 흔든 상태로 둡니다.
10. 상층액을 흡인하고 2분 동안 IVD당 PBS 10mL + 1% P/S를 첨가하여 IVD를 헹굽니다.

2. IVD 배양 및 로딩

1. 디스크를 IVD 챔버로 옮기고 IVD 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 생리학적 그룹의 경우 4.5g/L 고포도당 DMEM, 병리학적 그룹의 경우 2g/L 저포도당 DMEM) + 1% P/S + 2% 태아 송아지 혈청 + 1% ITS(5μg/mL 인슐린, 6μg/mL 트랜스페린 포함, 및 5ng/mL 셀레니어산) + 50μg/mL 아스코르브산염-2-인산염 + 1% 비필수 아미노산 + 일차 세포용 50μg/mL 항균제)를 넣고 37°C, 85% 습도 및 5% CO₂의 인큐베이터에 넣습니다.
2. 실험 그룹에 따라 생물 반응기 시스템 내에서 4일 동안 디스크를 배양합니다. 병리학적 그룹에서 2시간/일 동안 0.32-0.5MPa, 5Hz에서 퇴행성 로딩 조건을 유지합니다. 생리적 대조군에서 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz의 로딩 프로토콜을 사용하여 2 시간/일에 대해
   메모: 로딩 절차 중에 5mL의 IVD 배지가 들어 있는 챔버에 IVD를 놓습니다. 부피는 생물 반응기의 로딩 챔버 크기에 따라 다릅니다. 로딩 절차 사이에 자유 팽창 회복을 위해 7mL의 IVD 배양 배지가 있는 6웰 플레이트에 IVD를 놓습니다.
3. 실험 기간 동안 디스크 높이의 변화를 분석하기 위해 IVD 절제(기준선) 후 캘리퍼로 디스크 높이를 측정한 다음 자유 팽창 기간 후 및 실험 기간 동안 동적 하중 후 매일 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아스코르브산염-2-인산염	Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스	A8960
띠톱	Exakt Apparatebau, 노르더슈테트, 독일	모델 30/833
베타딘	Munndipharma, 프랑크푸르트, 독일
코닝 ITS 프리믹스	Corning Inc., 미국 뉴욕	354350
DMEM 고포도당	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	10741574
DMEM 저포도당	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	11564446
분자 생물학을 위한 에탄올	Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스	09-0851
소 태아 세럼(FBS)	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	A4766801
Non-essential 아미노산 용액	Gibco by life technologies, 미국 칼즈배드	11140050
페니실린/스트렙토마이신(P/S)	GIBCO by Life Technologies, 미국 칼즈배드	11548876
인산염 완충 용액, 정제	Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스	P4417
프리모신	InvivoGen, 미국 산디에이고	개미-PM-05
Pulsavac 제트 세척 시스템	짐머, 인디애나, 미국

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