조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

Abstract

출처: Assetta, B., et al., Neuron-Oligodendrocyte Interactions를 모델링하기 위한 만능 줄기 세포에서 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포의 생성. J. Vis. 특급. (2020).

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

Protocol

1. 인간 만능 줄기 세포에서 인간 뉴런 유도

1. 렌티바이러스 준비(~5일, 앞서 설명한 바와 같은 세부 프로토콜)
   1. 각 T75 플라스크에 ~100만 개의 HEK293T 세포를 플레이트링하여 transfection을 수행할 때 ~40%의 융합도를 갖도록 합니다. 테트라사이클린에 의해 유도되는 Ngn2 및 퓨로마이신 내성 유전자(PuroR, 동일한 TetO 프로모터 제어 하에서), rtTA 및 3개의 헬퍼 플라스미드 pRSV-REV, pMDLg/pRRE 및 VSV-G(렌티바이러스 벡터 DNA 12μg 및 헬퍼 플라스미드 DNA 각 6μg)를 발현하는 플라스미드로 transfection합니다. 렌티바이러스 제제당 최소 3개의 플라스크를 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 PEI를 사용하여 transfection을 수행합니다. 16시간 후에 미디어를 교체하고 폐기하십시오.
   2. Harvest는 매일 배양 배지를 수집하여 바이러스 입자를 방출하고 3일 동안 새로운 배지로 교체했습니다. 정제를 위해 바이러스 입자가 포함된 수집된 배지를 풀링합니다. 0.22μm 필터를 통해 바이러스를 여과하고 49,000 x g에서 90분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 적절한 부피의 PBS-포도당(~150μL)에 재현탁합니다.
2. 뉴런 유도 (~5일)
   메모: 이 유도 프로토콜(그림 1A, 흐름도)은 검증된 다능성의 iPS 및 ES 세포 모두에 매우 효과적입니다(이는 잘 특성화된 다능성 마커의 면역조직화학 염색으로 분석할 수 있음; 그림 1B).
   1. 52의 통로에서 시판되는 H1 인간 ES 세포를 사용합니다(재료 표 참조). ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)를 사용하여 세포외 기질 용액으로 코팅된 6-well 플레이트(6-well 플레이트당 ~0.5mg의 매트릭스 용액, 재료 표 참조)에서 세포를 배양하고 37°C에서 5% CO₂로 플레이트를 배양합니다.
   2. -2일차에, 세포 분리 용액 1mL(재료 표 참조)로 ES 세포(80% 융합)를 분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 튜브로 옮기십시오. 2mL의 배지로 웰을 세척하고 동일한 튜브에 결합하십시오. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 배지에 재현탁시키고, 웰당 1 x 10₅ 세포의 파스딩 밀도로 매트릭스 코팅된 6-웰 플레이트에 세포를 플레이트팅합니다.
   3. Day -1에 폴리브레네(8 μg/ml)와 함께 Ngn2와 PuroR 및 rtTA를 발현하는 렌티바이러스를 새로운 ES 세포 유지 배지의 ES 세포에 추가합니다(재료 표 참조). 바이러스의 정확한 양은 실제 역가 또는 적정에 의해 결정되어야 합니다. 일반적으로 6-well 플레이트에 웰당 각 5μL를 추가합니다.
   4. 0일차에 모르포겐이 없는 N2 보충제와 함께 DMEM-F12 배지에 Doxycycline(Ngn2 발현 활성화를 위한 2μg/mL)을 추가합니다.
   5. 1일차에 DMEM-F12와 N2 및 독시사이클린의 새로운 배지에 퓨로마이신을 첨가하여 최종 농도인 1μg/mL 배지에 추가합니다. 최소 24시간 동안 Puromycin에서 형질도입된 세포를 선택합니다. 바이러스 역가가 낮은 경우 형질도입된 세포를 적절하게 제거하기 위해 더 높은 Puromycin 농도(최대 5μg/mL)와 더 긴 선택 기간(최대 48시간)이 필요할 수 있습니다.
   6. 2일차에는 세포 분리 용액(Table of Materials)으로 분화 뉴런을 분리하고, 매트릭스 용액(Table of Materials)으로 코팅된 24-well plate(80,000–200,000 cells/well)에 다시 플레이팅하고, doxycycline 없이 NBA/B27 medium으로 유지합니다. 파종 밀도는 매우 중요합니다.
   7. 이 단계에서 분리된 뉴런은 특수 상업용 냉동 매체(재료 표 참조)에서 동결하고 최대 3개월 동안 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 순수한 뉴런은 해동 후 전형적인 ~15%-20%의 세포 사멸을 설명하며, 단독으로 배양하거나 다른 뇌 세포 유형과 함께 배양할 수 있습니다.
   8. 제조업체의 지시에 따라 세포외 기질 기반 용액으로 코팅된 플레이트에서 순수 iN을 배양합니다(재료 표 참조). 특징적인 피라미드 형태는 4일차(및 6일차; 그림 1C). 시냅스 형성은 빠르면 14일에서 16일째에 감지할 수 있으며 표준 시냅스 전후 마커를 사용한 면역조직화학적 염색에 의해 24일째에 두드러집니다. (그림 1D; 시냅스 전 마커 Synapsin 1 및 수지상 마커 Map2로 표시됨).

Results

그림 1: hPSC에서 인간 유도 뉴런(iN)의 직접 생성. (A) iN 생성의 흐름도. (B) 다능성을 확인하기 위한 인간 만능 줄기세포(H1)의 시작 배양에 대한 대표적인 명시야 및 면역형광 이미지. Oct4는 빨간색으로, Sox2는 녹색으로 표시됩니다. (C) 4일차와 6일차의 iN의 대표적인 명시야 이미지. (D) 순수 배양에서 24일 동안 배양하고 수지상 마커 Map2 및 시냅스 전 마커 Synapsin 1(Syn1)에 대한 면역형광 염색으로 염색한 iNs의 수지상 가지화 및 시냅스 반점에 대한 특징적인 형태.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아카쿠타아제	스템셀 테크놀로지스	7920
B27 보충제	써모피셔	17504044
DMEM/F12 매체	스템셀 테크놀로지스	36254
디엠소	써모피셔	D12345
독시사이클린	밀리포어시그마	D3072
H1 인간 ES 세포	위셀	와01
마트리겔	코 닝	354234
mTeSR 플러스	스템셀 테크놀로지스	5825
N2 보충제	써모피셔	17502001
Neurobasal A 배지	써모피셔	제10888-022
비 필수 아미노산	써모피셔	제11140-050
페이	폭스바겐	제71002-812
pMDLg/pRRE	애드진	12251
폴리브레네	밀리포어시그마	TR-1003-G
pRSV-레브	애드진	12253
푸로마이신	써모피셔	A1113803
STEMdiff 신경 전구 냉동 매체	스템셀 테크놀로지스	5838
STEMdiff SMADi 신경 유도 키트	스템셀 테크놀로지스	8581
Tempo-iOlogo: 인간 iPSC 유래 OPC	템포 바이오사이언스	SKU102
TetO-NG2-Puro	애드진	52047
브이에스이브이-지	애드진	12259