마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

Abstract

출처: Hubbard, K. et al., 줄기세포 유래 중추신경계 뉴런의 네트워크 배양에서 생물학적 신경독소의 기능적 평가.J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

Protocol

1. 신경 분화

참고: 1.1 - 1.5단계는 정오 이전에, 1.7단계는 정오 이후에 수행합니다. 차별화 절차에 대한 개요는 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 350 μl(3.5 x 10⁶)의 ESC를 25 ml 분화 배지를 함유한 10 cm 저부착 접시에 옮깁니다. 조직 배양 인큐베이터 내부에서 37 ° C에서 5 % CO₂로 30-45 rpm으로 설정된 오비탈 쉐이커에 놓습니다. 이날은 시험관 내 일(DIV) -8.
   이라고 하는 분화의 첫 번째 날입니다. 메모: 초저 부착 접시를 사용하면 방법 비용이 증가하지만 골재가 때때로 페트리 접시에 부착될 수 있기 때문에 박테리아 페트리 접시보다 약간 더 큰 수율을 생성합니다. 다른 접시 크기를 선호하는 경우 중간 부피와 세포 수를 그에 따라 확장할 수 있습니다.
2. 48시간(DIV -6) 후 25ml 피펫을 사용하여 분화 세포 응집체를 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 즉시 페트리 접시에 신선한 25ml의 분화 배지를 추가합니다.
3. 응집체가 2 - 5 분에 걸쳐 침전되도록 하여 1 - 2 mm 깊이의 눈에 보이는 펠릿을 생성합니다. 현탁액에 남아 있는 단일 세포 또는 작은 응집체는 무시합니다. 배지를 조심스럽게 흡인하고 P1000을 사용하여 세포 펠릿을 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 조직 배양 인큐베이터의 로터리 셰이커에 놓습니다.
4. DIV -4에서 1.2단계를 반복합니다. 펠릿의 깊이는 2 - 4mm입니다. 6μM all-trans retinoic acid(RA)가 보충된 30ml 분화 배지를 페트리 접시에 교체합니다. 조직 배양 인큐베이터의 회전식 셰이커로 다시 48시간 동안 기다립니다.
5. DIV -2에서 1.3단계를 반복합니다. 이 시점에서 펠릿의 깊이는 4 - 8 mm가 됩니다.
6. DIV -1에서 섹션 2와 같이 도금 표면을 준비합니다.
7. DIV 0에서 사전 분주 및 냉동 NPC 트립신화 배지 5ml를 37°C에서 5 - 10분 동안 해동하고 조직 배양 후드에 넣습니다. 25ml 피펫을 사용하여 분화 응집체를 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 응집체가 가라앉을 때까지 하고 매체를 조심스럽게 흡인합니다. 펠릿을 10ml PBS로 두 번 세척하여 세척 사이에 골재가 가라앉도록 합니다.
8. 두 번째 PBS 세척 후 펠릿에 NPC 트립신화 배지 5ml를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 2.5분 후에 튜브를 부드럽게 튕깁니다.
9. 0.1% 대두 트립신 억제제(STI) 5ml를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 반전하여 혼합합니다. 비교적 균질한 세포 현탁액이 생성될 때까지 10ml 혈청학적 피펫으로 10 - 15회 부드럽게 분쇄합니다.
10. 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브 상단에 놓인 40μm 또는 70μm 세포 여과기로 천천히 옮깁니다. 모든 현탁액이 여과되면 1ml의 N2 배지를 첨가하여 필터를 통해 나머지 세포를 세척하고 해리된 세포 현탁액을 200 x g에서 6분 동안 펠렛
화합니다.
11. 펠릿을 방해하지 않고 매체를 흡입하십시오. 10ml N2 배지로 셀을 두 번 세척하고, 200 x g에서 5분 동안 셀을 펠릿화하고, P1000으로 세척 중간에 트리분팅합니다. 두 번째 세척 전에 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
12. N2 배지에서 1 x 10 ml당⁷ 세포를 재현탁하고 150,000 - 200,000 cells/cm2의 세포 밀도로 ESN을 플레이트
화합니다.
13. 새로 도금된 ESN을 37°C 및 5% CO₂의 가습된 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 섹션 3과 같이 유지합니다.

2. DIV 0에서 신경 전구체를 도금하기 위한 배양 표면 준비

1. 조직 배양 처리된 접시는 플레이팅 최소 1일 전에 준비합니다. 조직 배양 처리된 플라스틱 접시를 덮고 37°C에서 O/N을 배양하기 위해 충분한 폴리에틸렌이민(PEI, 멸균 H₂O에서 25 μg/ml) 또는 폴리-D-라이신(PDL, 멸균 H₂O에서 100 μg/ml)을 추가합니다.
2. 도금 아침에 이중 증류 H₂O로 두 번, PBS로 한 번 설거지하십시오. 최종 세척 후 접시를 덮을 수 있도록 충분한 N2 배지를 추가합니다(예: 12웰 접시의 웰당 1ml 또는 6cm 접시당 4ml).
3. 뉴런 도금 최소 하루 전에 18mm 유리 커버슬립을 준비하십시오. 플라즈마 세척으로 커버슬립을 4분 동안 청소합니다.
4. 세척된 커버슬립을 대형 멸균 접시 바닥에 있는 에탄올 세척 파라필름으로 즉시 옮기고 2.1단계에서와 같이 준비된 400μl의 PEI 또는 PDL 용액을 추가합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C의 O/N을 배양합니다.
5. 아침에 커버슬립을 물로 3회 세척하고 37°C에서 1-3시간 동안 PBS에 5μg/ml 라미닌을 첨가합니다.뉴런을 해리하기 전에 라미닌을 흡인하고 즉시 커버슬립을 1ml의 NPC 배지가 들어 있는 12웰 접시의 웰로 옮기고 처리된 면이 위를 향하도록 합니다.
6. NPC가 접시에 담을 준비가 될 때까지 접시와 커버슬립을 37°C에서 보관하십시오.

3. 뉴런 유지

1. DIV 1에서 배지를 흡인하고 N2 배양 배지로 교체합니다.
2. DIV 2 및 4에서 배지를 흡인하고 B27 배양 배지로 교체합니다.
3. DIV 8에서 배지를 흡인하고 유사분열 억제제를 함유한 B27 배양 배지로 교체하여 비신경 세포를 오염시키는 것을 제거합니다.
4. DIV 12에서 B27 배양 배지로 교체합니다.
5. 사용할 준비가 될 때까지 5% CO₂에서 DIV 12⁺ ESN을 제거하지 마십시오.

Results

그림 1. 현탁액에 적응된 ESN은 유사분열적으로 안정된 상태를 유지하고 다능성의 마커를 발현합니다.(A) ESC 유지 및 차별화의 개략도. 레티노산(RA) 또는 백혈병 억제 인자(LIF)의 유무는 + 또는 –로 표시됩니다. 일차 뉴런 배양에 대한 시험관 일수(DIV)와 고전적 발달 단계(DS)를 비교합니다. (B) R1, D3 및 C57BL/6J ES 세포주에 대한 증식률은 현탁 배양으로 전환한 후 5개 계대만큼 안정화됩니다. (C) 유세포 분석 데이터는 현탁 배양에서 25개 계대에 걸쳐 측정된 R1, D3 및 C57BL/6J ES 세포주에서 Oct3/4 발현에 실질적인 변화가 없음을 보여줍니다(각각에 대해 n ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
녹아웃 DMEM	생명 기술	제10829-018	매체: ESC 배양 배지 제형 및 노트: 500 mL
MEM NEAA 100개	생명 기술	제11140-050	매체: 4°C에서 최대 1개월 동안 보관 제형 및 노트: 6mL
200mM L-알라닐-L-글루타민	증권 시세	30-2115	6 밀리리터
ES 인증 FBS	응용 줄기세포	ASM-5007	90 밀리리터
항생제 100개	시그마-알드리치	A5955	3 밀리리터
55mM 2-메르캅토에탄올	생명 기술	21985-023	1.1 밀리리터
107 단위/mL LIF	밀리포어	ESG1107	60 μL
녹아웃 DMEM	생명 기술	제10829-018	배지: ESC 분화 배지 제형 및 노트: 436.6 mL
MEM NEAA 100개	생명 기술	제11140-050	매체: 4°C에서 최대 1개월 동안 보관 제형 및 노트: 5mL
200mM L-알라닐-L-글루타민	증권 시세	30-2115	5 밀리리터
ESC 인증 세럼	응용 줄기세포	ASM-5007	50 밀리리터
항생제 100개	시그마-알드리치	A5955	2.5 밀리리터
55mM 2-메르캅토에탄올	생명 기술	21985-023	0.9 밀리리터
둘베코의 PBS	시그마-알드리치	D8537	매체: NPC 트립신화 배지 제형 및 노트: 100mL
0.5M EDTA (18.3%)	시그마-알드리치	3690	매체: 5mL 분취액에서 동결 제형 및 노트: 0.266mL
트립신	시그마-알드리치	T8802	50의 mg의
폴리에틸렌이민(PEI)	시그마-알드리치	P3143	매체: 표면 코팅 용액 제형 및 노트: H20에서 2.5μg/mL
폴리-D-라이신(PDL)	시그마-알드리치	P7280	매체: 1주 이내에 사용 제형 및 참고: H20에서 100μg/mL
라미닌	시그마-알드리치	엘2020	H20에서 5μg/mL
DMEM/F12 + 글루타맥스	생명 기술	제10565-018	매체: NPC 배양 배지 제형 및 노트: 492.5 mL
N2 비타민 100배	생명 기술	제17502-048	매체: 4°C에서 최대 1개월 동안 보관 제형 및 노트: 5mL
항생제 100개	시그마-알드리치	A5955	2.5 밀리리터
신경기저 A	생명 기술	제10888-022	매체: ESN 배양 배지 제형 및 노트: 482.5 mL
비타민 B27 50배	생명 기술	제17504-044	매체: 4°C에서 최대 1개월 동안 보관 제형 및 노트: 10mL
200mM L-알라닐-L-글루타민	증권 시세	30-2115	5 밀리리터
항생제 100개	시그마-알드리치	A5955	2.5 밀리리터
5-플루오로-2'-데옥시우리딘(5FDU)	시그마-알드리치	F0503	매체: 2000x 유사분열 억제제 분취 및 -20°C에서 보관 제형 및 참고: dd 150mg 5FDU 및 350mg 우리딘 to 10mL Neurobasal A. 멸균 필터, 분취 및 동결. ESN 배양 배지에서 2000x를 사용합니다.
우리딘	시그마-알드리치	U3003
TrypLE 익스프레스 트립신	생명 기술	제12605-010	매체: 기타 제형 및 노트: RT에 보관
디엠소	시그마-알드리치	D8418	RT에 저장
대두 트립신 억제제(STI)	시그마-알드리치	T6414	-20 °C에서 보관하십시오
에탄올	시그마-알드리치	E7023	RT에 저장
아스코르브산	시그마-알드리치	A4403	5.7mL의 50:50 DMSO/에탄올 혼합물에 100mg의 아스코르브산을 용해하여 100mM 스톡을 준비합니다.
레티노산(RA)	시그마-알드리치	R2625	15mg RA를 9mL 50:50 DMSO/에탄올에 재현탁합니다. 100mM 아스코르브산 스톡 1mL를 보충합니다. 부분 표본 및 -80 °C에서 보관. 6 개월 동안 안정적입니다.
플라즈마 클리너	해릭 플라즈마	PDC-32G
Olympus IX51 도립 현미경	올림푸스	해당 사항 없음
18mm 유리 커버슬립	어부	Tel.: 12-545-84
셀 스트레이너(40μm)	어부	08-771-1
스토발 벨리 댄서 셰이커	어부	제15-453-211
저접착 접시	어부	TEL.05-539-101	코닝 3262
세균 접시	폭스바겐	제25384-302	100 x 15 밀리미터