마우스 좌골 신경에서 슈반 세포의 자기 분리

초록

출처: Blusch, A., et al., 쥐 등뿌리 신경절 외식과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 체외 수초화. J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 쥐의 좌골 신경 섬유에서 슈반 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 슈반 세포 배양

1. 슈반 세포 배양을 위한 코팅
   1. 멸균 상태에서 세포 배양 접시를 코팅합니다. 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 2mL를 각각 60mm 조직 배양(TC) 접시 2개에 적용하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. PLL을 제거하고 TC 접시를 증류수로 2번 씻고 4°C에서 하룻밤 동안 1μg/cm² 라미닌 2mL로 배양합니다. TC 접시를 아쿠아 데스트로 2번 씻고 접시를 자연 건조시킵니다.
2. 슈반 세포 배양을 위한 배지 준비
   1. 멸균 조건에서 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM)/F-12(고포도당)에 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2μM 포스콜린, 10nM 뉴레굴린 및 50μg/mL 겐타마이신을 첨가하여 50mL의 Schwann 세포 배지를 준비합니다.
   2. 멸균 조건에서 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 Leibovitz의 L-15 배지 70mL를 준비합니다.
3. 좌골 신경의 효소 소화
   참고: 다음 단계는 멸균 상태에서 수행됩니다.
   1. 10mL의 DMEM(고포도당)에 0.25% dispase II, 0.05% type I 콜라겐분해효소 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 효소 분해 용액을 준비합니다.
   2. 188 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고, 25mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 1,000mL 피펫을 사용하여 나머지 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠릿을 60mm 조직 배양 접시에 옮깁니다.
   3. 50mL 튜브를 효소 소화 용액 10mL로 헹구고 신경 섬유가 들어있는 접시에 넣으십시오. 소화를 위해 접근 가능한 표면을 최대화하기 위해 피펫 끝으로 접시에 조직을 조심스럽게 분배합니다.
   4. 37°C 및 5% CO₂에서 18시간 동안 배양하고 Ca²⁺ 및 Mg²⁺(HBSS) 없이 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액에 10mL의 40% FCS를 첨가하여 분해를 중지합니다.
4. 세포 분리
   1. 혈청학적 피펫과 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 188 x g의 원심분리를 사용하여 소화된 신경을 50mL 튜브로 옮깁니다.상등액을 버리고 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 10mL의 DMEM에 펠렛을 재현탁합니다. 이후 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL 및 200 μL 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 20회 재현탁합니다.
   2. 100μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하고 4°C에서 10분 동안 188 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10% FCS와 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 DMEM 4mL로 펠릿을 재현탁합니다.
   3. 두 개의 PLL 및 라미닌 코팅된 60mm TC 접시 각각에 2mL의 세포 현탁액을 추가하고 37°C 및 5% CO₂에서 배양합니다. 인큐베이터에서 2일 동안 플레이트를 손대지 않은 상태로 두어 기계적 스트레스로부터 세포를 보호하고 접착력을 높입니다.
5. Schwann 세포 분화
   1. 2일 후 배지를 제거하고 DMEM(고포도당), 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신으로 플레이트를 2x 조심스럽게 헹굽니다. 그 후, Schwann 세포 배지 2mL를 첨가합니다. 2일마다 Schwann 세포 배지를 교체하고 현미경을 사용하여 세포 모양과 포화도를 관찰합니다.
6. 세포 트립신화(cell trypsinization) 및 자기 분리
   1. 세포가 약 80%의 포화도(배양 6-12일)에 도달하면 3mL의 DPBS로 플레이트를 2x 조심스럽게 세척하고 0.05% 트립신/EDTA 2mL(37°C로 예열)로 3분 동안 배양합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 분리되면 10% FCS가 포함된 DMEM 2mL와 50μg/mL 겐타마이신.
      을 첨가하여 분해를 비활성화합니다. 메모: 엄격하게 3분의 트립신화 시간을 고수하고 그 후에 빠르게 진행하십시오.
   2. 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2nM EDTA가 포함된 DPBS를 함유한 2mL의 자기 세포 분리 완충액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 결합하고 염색 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
   3. 4°C에서 10분 동안 188 x g에서 세포 현탁액을 원심분리하고 1 x 10⁷ 세포당 90μL의 자기 세포 분리 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 1 x 10⁷ 세포당 10μL의 Thy-1 마이크로비드를 추가합니다. 용액을 몇 번 재현탁시키고 8 ° C의 어둠 속에서 15 분 동안 배양합니다.
   4. 2mL의 자기 세포 분리 완충액을 세포 현탁액에 추가하고 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 펠릿을 500μL의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다.
   5. 자기 세포 분리 컬럼을 1mL의 자기 세포 분리 버퍼로 적십니다. 자기 세포 분리 컬럼을 자기 세포 분리기에 놓습니다. 세포를 자기 세포 분리 컬럼에 적용합니다. 흐름을 수집하고 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리
      메모: 섬유아세포는 긍정적으로 선택되어 컬럼에 남는 반면, 슈반(Schwann) 세포는 컬럼을 통과합니다. 섬유아세포는 스탬프(stamp)로 채취할 수 있습니다(예: 슈반(Schwann) 세포 염색 프로토콜에 대한 음성 대조군).
   6. 상등액을 버리고 펠렛을 1mL의 공동 배양 배지에 재현탁합니다. 트리판 블루(trypan blue)와 염색 챔버(staining chamber)로 염색한 후 세포를 세어봅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민	Carl Roth, 독일 카를스루에	8076.4
셀 스트레이너, 100 μM	BD Bioscience, 하이델베르크, 독일	제352360
원심분리기 5810-R	Eppendorf AG, 함부르크, 독일	5811000015
CO2 인큐베이터 Heracell	Heraeus Instruments, 하나우, 독일	51017865
디스플레이 II	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	4942078001
증류수(정수 시스템)	Millipore, Molsheim, 프랑스	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, 글루타맥스	Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테	31331093
DPBS(칼슘 이온 및 마그네슘 이온 없음)	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	D8537-6X500ML
증권 시세	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	F7524	FCS는 슈반 세포 배양을 위해 테스트해야 합니다
겐타마이신	Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테	5710064
HBSS(칼슘 이온 및 마그네슘 이온 없음)	Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테	14170138
라미닌	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	L2020-1MG
MACS 멀티스탠드	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	130042303
마이크로 가위	Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일	15000-08
현미경	Motic, Wetzlar, 독일	모틱 BA 400
현미경 슬라이드	VWR, 래드너, 미국	630-1985
MiniMACS 분리기	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	130091632
MS 컬럼	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-042-201
노이바우어 계수 챔버	어시스턴트, 독일 에를랑겐	40441
피 펫	Eppendorf AG, 함부르크, 독일	2231300004
폴리-L-라이신	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	P4707-50ML
혈청학적 피펫, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, 독일	861254025
혈청학적 피펫, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, 독일	861685001
혈청학적 피펫, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, 독일	861253001
TC 접시 60, 셀 +	Sarstedt, Nümbrecht, 독일	833901300
Thy-1 마이크로비즈(MACS 키트)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-094-523
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테	제25300-054
유형 I 콜라겐 분해 효소	Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일	C1639
수조 유형 1008	GFL, 부르크베델, 독일	4285

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