Horizontal Mouse Hippocampal Brain Slices 얻기

초록

출처: Van Hoeymissen, E., et al. 쥐 뇌의 수평 해마 조각. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하는 데 중점을 두고 마우스에서 수평 해마 뇌 절편을 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 이 과정에는 뇌를 조심스럽게 이등분하고 고정하고, 절단을 위해 진동을 사용하고, 발암액으로 최적의 조직 상태를 유지하여 추가 실험을 위해 준비된 해마 뇌 절편을 만드는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 고 자당 슬라이스 용액 및 인공 뇌척수액 (ACSF)의 제조

1. 실험일 이전
   1. 25 KCl, 20 CaCl₂, 10 MgSO₄, 12.5 KH₂PO₄를 포함하는 실험실 등급 Type 1 물로 10x 슬라이스 사전 용액 1L를 준비합니다(표 1). 인산칼슘 침전을 방지하기 위해 자석 교반기로 계속 교반하면서 800mL H₂O가 미리 채워진 비이커에 화학 물질을 천천히 혼합합니다. 용액을 4°C 또는 실온(RT)에서 보관하십시오.
2. 실험 당일
   1. 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgSO₄, 1.25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 25 포도당을 포함하는 실험실 등급 유형 1 물로 1x ACSF 1L를 준비합니다(표 2). 증기압 삼투압계를 사용하여 305–315mOsm(pH ~ 7.55–7.6).
      사이의 삼투압을 검증합니다. 메모: 인산 칼슘 침전을 방지하기 위해 800mL의 H₂O가 미리 채워진 비커에 모든 고체 화학 물질을 천천히 혼합하면서 자기 교반기로 계속 저어줍니다. 맨 끝에 MgSO₄ 및 CaCl₂를 첨가하여 1M 원액에서 필요한 양을 천천히 떨어뜨립니다.
   2. 실온에서 1x ACSF 용액을 탄소와 함께 지속적으로 버블링하여 pH를 7.3–7.4.
      사이로 설정합니다. 메모: pH가 약간 너무 높거나 너무 낮으면 발암 강도를 약간만 조정하면 충분합니다. 발암으로 pH가 7.45보다 높으면 1M NaH₂PO₄ 용액을 몇 방울 떨어뜨려 조정하십시오.
   3. 25mL의 10x 슬라이스 사전 용액 및 (mM) : 252 자당, 26 NaHCO₃ 및 10 포도당을 포함하는 비이커에 250 mL (뇌 당)의 1x 고 자당 슬라이스 용액을 준비합니다 (표 3). 삼투압이 320–325mOsm(pH ~ 7.55–7.6) 사이인지 확인합니다.
   4. 고자당 슬라이스 용액을 탄소로 10-15분 동안 거품을 일으켜 pH를 7.3–7.4.
      사이로 제어합니다. 메모: 발암으로 pH가 7.45보다 높으면 1M KH₂PO₄ 용액 몇 방울을 추가하여 조정하십시오.
   5. 고자당 슬라이스 용액을 부분적으로 얼 때까지 울트라 냉동고(-80 °C)에 20-30분 동안 보관하십시오.

2. 쥐 뇌의 해부 및 위치

1. 냉각된 35mm 배양 접시에 뇌를 옮기고 ACSF로 채워진 파스퇴르 피펫(혈액은 뇌 조직에 세포독성 효과가 있음)으로 뇌를 부드럽게 씻어 조직에서 모든 머리카락이나 혈액 입자를 제거합니다.
2. 식힌 90mm 배양 접시 위에 불린 여과지에 주걱을 사용하여 뇌를 이식합니다(그림 1A).
3. 칼날을 사용하여 뇌를 반으로 자르고 두 반구를 분리하고 두 반구를 갓 자른 내측에 놓습니다.
4. 칼날을 사용하여 각 반구에서 뇌의 등쪽 부분(5%-10%)을 등쪽 상단과 평행하게 절단하여 제거하고(그림 1C) 뇌의 복부 부분이 위쪽을 향하도록 하여 새로 절단한 쪽에 양쪽 반구를 놓습니다.
5. 표본 플레이트에 슈퍼 접착제 한 방울을 놓고 양쪽 반구를 수용할 수 있도록 피펫 팁으로 적절하게 펼칩니다.
6. 여과지 스트랩을 사용하여 여과지 스트랩으로 복부 쪽을 만져 모세관의 힘으로 한쪽 반구를 집어 조직이 손상되지 않도록 합니다.
7. 다른 여과지 스트랩을 사용하여 뇌의 등쪽을 조심스럽게 반건조시킨 후 반구를 등쪽이 아래로 향하게 하여 표본 플레이트의 접착제 위에 놓습니다. 두 번째 반구에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
   메모: 반구는 비브라톰 플레이트에서 거울 방식으로 수평 정렬로 배치되어야 하며, 꼬리 쪽은 바깥쪽을 가리키고 꼬리 쪽은 중앙에서 서로 마주보지만(닿지 않음) 위치해야 합니다. 양쪽 반구의 내측은 비브라톰 블레이드를 향하고 측면은 실험자를 향해야 합니다(그림 1D).
8. 시편 플레이트를 슬라이싱 챔버에 놓고 빠르지만 조심스럽게 얼음처럼 차가운 고자당 슬라이스 용액 슬러시로 덮습니다. 용액이 접착제에 닿자마자 응고되어 반구를 시편 플레이트에 적절하게 접착합니다.
9. 반구가 고자당 슬라이스 용액으로 제대로 덮여 있는지 확인하고 용액이 carbogen.
   으로 거품이 일었는지 확인합니다. 메모: 전체 해부 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. 뇌가 산소 공급 없이 매우 오랫동안 머물지 않도록 하십시오. 참수에서 고자당 슬라이스 용액 슬러시에 뇌가 잠기는 것까지 약 1-1.5분 밖에 걸리지 않습니다. 이것은 높은 품질의 슬라이스를 보장하기 위해 급성 뇌 절편 준비에 대한 가장 중요한 요구 사항입니다.

3. 뇌의 수평 슬라이싱

1. 비브라톰 블레이드를 반구의 내측 앞에 놓고 현재 위쪽을 향하고 있는 반구의 복부 쪽과 같은 높이로 내립니다. vibratome control의 도움으로 블레이드를 등 방향으로 600μm 더 낮추고 슬라이싱을 시작합니다. 칼날이 조직에 부딪혀야 합니다(그렇지 않은 경우 날을 뒤집고 조금 더 낮추십시오). 처음 두 조각이 두 반구에서 완전히 분리될 때까지 조각합니다.
2. 날을 뒤집어 300μm 더 낮추고 다시 자릅니다.
3. 해마가 보이면(필요한 경우 마우스 뇌 지도를 사용하여 도움을 받음)(그림 1E) 넓어진 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 조각을 수집합니다. caudate putamen이 해마 옆에 보일 때까지 조각을 수집합니다. 일반적으로 300μm의 8-12개 슬라이스(반구당 4-6개)를 마우스 뇌에 대해 수집할 수 있습니다.
4. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 조각을 수집하고 수조의 회수 챔버로 옮깁니다(그림 1F)(슬라이스 챔버에서 떠다니는 것을 방지하기 위해 각 슬라이싱 라운드 후에 슬라이스를 수집함).
   메모: 가능한 한 빨리 작업하고 전체 절차 동안 고자당 슬라이스 용액이 얼음처럼 차갑고 발암되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 슬라이스 챔버를 둘러싼 얼음을 다시 채웁니다.

4. 전기생리학적 기록을 위한 뇌 절편 복구

1. ACSF로 채워진 회수 챔버의 슬라이스를 32°C 수조에 1시간 동안 그대로 둡니다
   참고: 회수실은 상업적으로도 이용 가능합니다.
2. 수조에서 회수 챔버를 꺼냅니다.
3. 추가 적용을 시작하기 전에 복구를 위해 최소 30분 동안 슬라이스를 RT에 놓습니다.

버퍼 및 미디어 레시피.

표 1: 10 x 슬라이스 사전 용액(1L).

분 분 호 분 명 년 분 명 호 분

화합물	농도 (mM)	분자량 (g / mol)	금액 (g)
케이클	25	74.55	1.86
칼슘2 * 2H2O	20	147.01	2.94
마그네슘4 * 7H2O	10	246.48	2.46
KH2사서함4	12.5	136.08	1.7

표 2: 1x ACSF(1L)(삼투압 305–315mOsm).

의 분 호 분 호 개 개 호 년 분 월 호 분 명 분

화합물	농도 (mM)	분자량 (g / mol)	금액 (g)
염화나트륨	125	58.44	7.3
케이클	2.5	74.55	0.19
칼슘2 * 2H2O	2	1 M CaCl2 용액에서	2 mL
마그네슘4 * 7H2O	1	1 M MgSO4 용액에서	1 mL
나H2PO4 * 2H2O	1.25	156.02	0.2
나HCO3	26	84.01	2.18
포도당 * H2O	25	198.17	4.95

표 3: 1x 고자당 슬라이스 용액(250mL)(삼투압 320–325mOsm).

명 호 분 분 월 호 분 명 아까

화합물	농도 (mM)	분자량 (g / mol)	금액 (g)
10x 슬라이스 P해상도	해당 사항 없음	해당 사항 없음	25 밀리리터
자당	252	342.3	21.57
나HCO3	26	84.01	0.55
포도당 * H2O	10	198.17	0.49

결과

그림 1: 수평 해마 뇌 절편 준비에 대한 자세한 정보. (A) 설치류 뇌의 해부 및 절단에 필요한 도구 이미지: (a) 길이 ±2cm, 너비 ±0.5cm의 여과지 스트랩(예: 413등급) (b) 블레이드; (c) 슈퍼 접착제; (d) 피펫 팁; (e) 시편 플레이트(비브라톰과 함께 제공됨); (f) 35mm 배양 접시; (g) 미세한 브러시; (h) 주걱; (i) 구부러진 집게; (j) 해부 가위; (k) 강한 가위 (칼날 길이 10cm 이상); (l) 넓은 개구부 (직경 0.6-0.8cm)가있는 플라스틱 파스퇴르 피펫; (m) 회수 챔버(250mL 비커, 플라스틱 링, 나일론 메쉬, 10mL 혈청학적 피펫 조각으로 자체 제작); (n) 얼음으로 채워진 90mm 배양 접시와 (o) 냉장 배양 접시 위에 여과지 사각형....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
카보겐 탱크	에어리퀴드	알파가즈 믹스 B50	가스 혼합물 CO2 / O2 : 5/95, 순도 5
문화 접시 (35mm)	코닝 생명과학	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-세포-배양-접시/p/353001
문화 접시 (90mm)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
곡선형 집게	Fine Science 도구	11270-20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-(+)-포도당 일수화물	시그마 알드리치	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE
여과지	폭스바겐	전화: 516-0818	학년 413
가는 브러시	라파엘 캐렐	8204	크기 #1
록타이트 406	헨켈 접착 기술	록타이트 406	슈퍼 접착제
염소 칼륨	화학실험실	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
인산이수소칼	머 크	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
반구를 준비하기 위한 면도날	SPI 소모품	안전 카트리지 디스펜서 - pkg/10	GEM Scientific 단일 에지 면도날
비브라톰용 면도날	테드 펠라 Inc	121-6	양날 깨지기 쉬운 면도날(PTFE 코팅 스테인리스강)
회수 챔버	home made - 일반	해당 사항 없음	뇌 조각을 수집하고 저장하기 위해(자세한 내용은 원고에서 참조)
가위	모든 회사	해당 사항 없음	칼날은 잘 날카로워야 하며 쉽게 참수할 수 있도록 길이가 15cm 이상이어야 합니다.
나트륨 이수소 인산염 이수화물	머 크	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
탄산수소나트륨	알파 에자르	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
염화나트륨	피셔 사이언티픽	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
주걱	시그마 알드리치	S9147-12개	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE
자당	VWR 인터내셔널 주식회사	102745씨	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
발암물질, 관류 및 흡입 라인용 튜빙 1	워너 인스트루먼트	Tel.: 64-0167	표준 밸브 시스템용 Tygon 튜빙(TY-50)
발암제, 관류 및 흡입 라인용 튜빙 2	피셔 사이언티픽	800/100/200 & 800/100/280	Smiths Medical Portex 파인 보어 LDPE 튜빙
비브라톰	라이카	14912000001	반자동 진동 블레이드 microomei VT1200
수조	멤메르트	WNB 7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
정수 시스템	머 크	시너지 밀리포어	고도로 정제된 물을 얻기 위해