쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 조각의 생성

초록

출처: Bosch, D., et al. 뇌 절편에서 공포 회로의 생체 외 광유전학적 해부. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 슬라이스를 생성하는 방법을 보여줍니다. 뇌는 편도체와 시냅스 연결을 형성하는 내측 전전두엽 피질에서 편도체와 축삭을 포함하는 조각을 얻기 위해 진동 표본 단계에서 비스듬히 배치됩니다. 뇌 절편은 추가 실험을 위해 조직을 보존하기 위해 생리학적 온도로 유지됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 급성 슬라이스 준비

1. 인공 뇌척수액(ACSF), 절단 용액, 도구(가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫) 및 한천 블록을 준비합니다.
   참고: 실험당 1L의 인공 뇌척수액(ACSF)이 필요하며, 이전에 발표된 바와 같이 이중 증류된 H₂O에 화학 물질을 용해하여 준비합니다. 절단 용액은 ACSF 200ml에 2M MgSO₄ 원액 0.87ml를 보충하여 제조합니다.
2. 실험 전반에 걸쳐 95% O₂ 및 5% CO 2로 ACSF 및 절단 용액에 산소를 공급합니다_.
3. 이소플루란(산소 중 3%)을 사용하는 소동물 마취기를 사용하여 마우스를 깊이 마취합니다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오.
4. 큰 가위를 사용하여 마우스의 목을 베고 즉시 얼음처럼 차가운 절단 용액에 머리를 식히십시오.
5. 꼬리에서 꼬리까지 단일 정중선 절개로 두개골을 열고 집게를 사용하여 두개골 조각을 옆으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 작고 둥근 주걱을 사용하여 두개골에서 부드럽게 뇌를 들어 올려 빠르게 제거합니다. 메스로 소뇌를 잘라냅니다. 뇌를 얼음처럼 차가운 절단 용액에 넣으십시오.
6. 내측 전전두엽 피질 또는 mPFC 주사 부위: 메스를 사용하여 뇌의 앞쪽 부분(mPFC 포함)을 잘라내고 얼음처럼 차가운 절단 용액에 넣어 자를 때까지 넣습니다.
7. 여과지로 여분의 절단 용액을 제거하고 뇌의 뒤쪽 부분을 진동 스테이지에 붙입니다.
8. 기울어진 편도체 절편의 경우, 35° 각도로 절단된 한천 블록(4%)에 뇌를 붙입니다(그림 1D, 가운데). 관상 편도체 절편, 내측 생식기 핵/후층 내 시상핵(MGm/PIN) 주사 부위 및 mPFC 주사 부위의 경우 뇌를 스테이지에 직접 붙입니다(그림 1D, 왼쪽 및 오른쪽). 슬라이스하는 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 배치합니다.
9. 냉각 장치를 사용하여 4°C로 유지되는 얼음처럼 차가운 산소 절단 용액이 있는 절단 챔버에 스테이지를 놓습니다. 사파이어 블레이드를 사용하여 편도체(320μm)의 급성 슬라이스를 준비합니다. 실온(RT)에서 산소가 공급된 ACSF와 함께 공급되는 인터페이스 챔버에 슬라이스를 놓습니다.
10. 급성 편도체 절편을 준비한 후, 계면 챔버를 36 °C의 수조에 넣어 35 - 45분 동안 절편을 회수합니다. 그런 다음 인터페이스 챔버를 RT로 되돌립니다.
11. 1.10단계를 시작하는 동안 급성 편도체 절편에 대해 앞서 설명한 대로 주사 부위 절편을 절단합니다(1.8 - 1.9 단계). 수조에서 조각을 회수하는 것은 여기에서 필요하지 않습니다. 선택적: 주입 부위 위치를 빠르게 추정하려면 형광등과 적절한 필터 세트가 장착된 입체경으로 슬라이스를 관찰합니다.

결과

그림 1. 정위 주사, 급성 뇌 절편의 준비 및 시냅스전 섬유의 시각화.(A, B) 정위 바이러스 주사. A) 두개골이 노출된 정위 프레임에 배치된 마취된 마우스와 주입 피펫의 사진. 삽입 사진: 빠른 녹색과 혼합된 바이러스 용액으로 채워진 주입 피펫의 사진을 확대합니다. 스케일 바: 3mm. (B) 다양한 주입 영역에 대한 드릴 구멍의 위치가 표시된 마우스 두개골의 개략도. (C) 이 연구에 사용된 다양한 바이러스 구조를 보여주는 계획. 짙은 회색: 프로모터 서열; 청색: 채널로돕신2 (ChR2 (H134R)); 녹색/빨간색: 형광 단백질. 발현 시간은 국소 편도체 투영의 경우 2주, mPFC 및 MGm/PIN의 투영의 경우 4...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인공 뇌척수액(ACSF)
내부 패치 솔루션
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	Roth, 독일	P027.1	정제수에 2M 원액을 준비합니다.
슬라이서, Microm HM650V	Fisher Scientific, 독일	920120
티슈 슬라이서용 냉각 장치, CU65	Fisher Scientific, 독일	770180
사파이어 블레이드	델라웨어 다이아몬드 나이프		맞춤 주문, 회사에 문의
입체경, SZX2-RFA16	올림푸스, 일본
패치 현미경, BX51WI	올림푸스, 일본
수조 온도 조절기, TC05	Luigs & Neumann, 독일	200-100 500 0145
인터페이스 챔버용 셀룰로오스 질산염 여과지	Satorius Stedim Biotech, 독일	13006--50 ACN