Generating a Coronal Brain Slice: Exposed the Amygdala Regions from a Mouse Brain (코로나 뇌 슬라이스 생성하기: 쥐의 뇌에서 편도체 영역 노출)

Abstract

출처: Bosch, D., et al. 뇌 절편에서 공포 회로의 생체 내 광유전학적 해부. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 쥐의 뇌에서 얇은 관상 뇌 절편을 준비하여 내측 전전두엽 피질에서 시냅스 연결이 풍부한 편도체 영역을 노출시키는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 조각은 신경세포의 생존력을 유지하기 위해 산소가 공급된 인공 뇌척수액에서 회수됩니다.

Protocol

1. 급성 슬라이스 준비

1. ACSF, 절단 용액, 도구 (가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫) 및 한천 블록을 준비합니다 .
   참고: 실험당 1L의 인공 뇌척수액(ACSF)이 필요합니다. 이전에 발표된 바와 같이 ACSF는 이중 증류된 H2O에 화학 물질을 용해하여 제조됩니다. 절단 용액은 ACSF 200ml에 2M MgSO₄ 원액 0.87ml를 보충하여 제조합니다.
2. 실험 전반에 걸쳐 95% O₂ 및 5% CO₂로 ACSF 및 절단 용액에 산소를 공급합니다.
3. 이소플루란(산소 3%)을 사용하여 작은 동물 마취기를 사용하여 마우스를 깊이 마취합니다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오.
4. 큰 가위를 사용하여 마우스의 목을 자르고 즉시 얼음처럼 차가운 절단 용액으로 머리를 식히십시오.
5. 꼬리에서 꼬리까지 정중선을 한 번 절개하여 두개골을 열고 집게를 사용하여 두개골 조각을 옆으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 작고 둥근 주걱을 사용하여 두개골에서 부드럽게 뇌를 들어 올려 뇌를 빠르게 제거합니다. 메스로 소뇌를 잘라냅니다. 뇌를 얼음처럼 차가운 절단 용액에 넣으십시오.
6. mPFC 주사 부위의 경우 메스를 사용하여 뇌의 전방부(mPFC 포함)를 절단하고 얼음처럼 차가운 절단 용액에 넣어 자를 때까지 넣습니다.
7. 여과지로 여분의 절단 용액을 제거하고 뇌의 뒤쪽 부분을 진동 스테이지에 붙입니다.
8. 코로나 편도체 절편, MGm/PIN 주입 부위 및 mPFC 주입 부위의 경우 뇌를 스테이지에 직접 붙입니다(그림 1D, 왼쪽 및 오른쪽). 자르는 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 놓습니다.
9. 냉각 장치를 사용하여 4°C로 유지되는 얼음처럼 차가운 산소 절단 용액이 있는 절단 챔버에 스테이지를 놓습니다. 사파이어 칼날을 사용하여 편도체의 관상 절편을 준비합니다. RT에서 산소가 공급된 ACSF가 공급되는 계면 챔버에 슬라이스를 놓습니다.

Results

그림 1. 정위 주사, 급성 뇌 절편 준비 및 시냅스 전 섬유의 시각화. (가, 나) 정위 바이러스 주입. A) 두개골이 노출된 정위 프레임에 배치된 마취된 마우스와 주입 피펫의 사진. 삽입 사진: 빠른 녹색과 혼합된 바이러스 용액으로 채워진 주입 피펫의 사진을 확대합니다. 스케일 바: 3mm. (B) 다양한 주입 영역에 대한 드릴 구멍의 위치가 표시된 마우스 두개골의 개략도. (C) 이 연구에 사용된 다양한 바이러스 구조를 보여주는 계획. 짙은 회색: 프로모터 서열; 청색: 채널로돕신2 (ChR2 (H134R)); 녹색/빨간색: 형광 단백질. 발현 시간은 국소 편도체 투영의 경우 2주, mPFC 및 MGm/PIN의 투영의 경우 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인공 뇌척수액(ACSF)	구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23을 참조하십시오
내부 패치 솔루션	구성에 대해서는 참고 문헌 #16 및 #23을 참조하십시오
슬라이서, Microm HM650V	Fisher Scientific, 독일	920120
티슈 슬라이서용 냉각 장치, CU65	Fisher Scientific, 독일	770180
사파이어 블레이드	델라웨어 다이아몬드 나이프
입체경, SZX2-RFA16	올림푸스, 일본