Hippocampal Dentate Gyrus의 비신경 세포에서 핵을 분리하는 기술

초록

출처: Kerloch, T., et al. 해마 신경인성 틈새를 연구하기 위해 단일 핵 RNA 염기서열 분석과 결합된 뉴런의 형광 활성화 핵 음성 정렬. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 쥐의 해마 치상회(hippocampal dentate gyrus, DG)에서 신경교세포와 줄기세포로부터 온전한 핵을 분리하는 방법을 보여줍니다. DG 조직은 핵을 방출하기 위해 저온 균질화 완충액에서 기계적으로 해리됩니다. 조직 파편 및 기타 방출된 소기관은 폐기되고 핵은 DNA 염색 및 신경 핵 항원(NeuN)에 특이적인 형광단 접합 항체로 염색됩니다. 그런 다음 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 비신경 세포의 NeuN 음성 핵을 분리합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. DG 해부 (타이밍 : 15 분)

1. 핵 분리 매체 1 및 2(NIM1 및 NIM2), 균질화 완충액(HB) 및 세척 매체(WM)를 준비합니다(표 1). 필요할 때까지 모든 버퍼, 미디어, 시약 및 도구를 얼음 위에 놓습니다. 준비하는 동안 Dounce 균질화기(재료 표 참조)를 얼음에 올려 놓습니다(균질화 단계 최소 1시간 전).
   메모: NIM1은 4°C에서 최대 6개월 동안 준비 및 보관할 수 있습니다. NIM2, HB 및 WM은 새로 준비해야 합니다.
   주의: 프로테아제 억제제인 디티오트레이톨(DTT)과 트리톤 X-100을 주의해서 다루십시오. 이러한 화합물은 피부와 눈을 자극하고 급성 독성이 있으며 수생 환경에 유해합니다. 이러한 화학 물질을 사용하는 동안 보호 장갑, 의복, 눈 및 얼굴 보호구를 착용하고 취급 후에는 손을 철저히 씻고 환경으로 배출되지 않도록 하십시오.
2. 22개월 된 수컷 C57Bl/6J 마우스를 Home Office Schedule 1 절차에 따라 경추 탈구로 안락사시킵니다.
   메모: 이 연구에서 22개월 된 마우스 사용에 관한 근거에 대한 토론을 참조하십시오. 그러나 이 프로토콜은 수명 전반에 걸쳐 모든 연령에서 수행할 수 있습니다.
3. 안락사된 쥐의 뇌를 해부하여 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 10cm 페트리 접시에 옮깁니다(그림 1). 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 메스를 사용하여 소뇌를 제거하고 양쪽 반구 사이(시상축을 따라)에서 뇌를 반으로 자릅니다.
4. 새 10cm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS를 채우고 얼음 위에 놓습니다. 뇌의 절반을 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 쌍안경을 사용하여 DG를 해부하고 이 단계를 반복하여 뇌의 후반부에서 두 번째 DG를 얻습니다.
   메모: 이러한 단계(1.2-1.4단계)는 앞서 설명한 절차에서 수정되었습니다. 세포의 무결성을 보존하기 위해 이 단계에서 가능한 한 빨리 진행하는 것이 중요합니다.
5. 두 개의 DG를 사전 냉각된 Dounce 균질기로 옮기고 1mL의 차가운 HB를 추가합니다.

2. 조직 해리, 단일 핵 분리 및 anti-NeuN 면역 염색 (타이밍 : 2 시간)

1. 느슨한 "A" 유봉을 10번 스트로크한 다음 단단한 "B" 유봉을 15번 스트로크하여 조직을 균질화합니다.
   메모: 마찰과 거품으로 인한 열을 줄이기 위해 얼음 위에서 모르타르를 부드럽게 두드려 균질화해야 합니다. 모든 버퍼와 장비는 사전 냉각되어 절차 중에 얼음 위에 보관되어야 합니다.
2. 균질액을 미리 냉각된 15mL 튜브로 옮기고 Dounce 균질기를 1mL의 차가운 HB로 헹구고 동일한 튜브에 결합합니다. 15mL 튜브에 HB 3mL를 넣고 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 2번 섞습니다.
3. 50mL 시험관에 0.5mL의 HB가 든 70μm 스트레이너 캡을 미리 적십니다. 15mL 튜브를 세포 여과기에 부드럽게 밀어 넣어 2.2단계의 핵 현탁액을 변형시킵니다. 세포 여과기를 HB 0.5mL로 세척합니다.
4. 셀 스트레이너를 제거하고 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 테스트 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 버립니다.
   메모: 균질액을 변형시키면 파편을 줄이는 데 도움이 되며, 이는 유세포 분석 및 단일 핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq) 다운스트림 단계에 중요합니다.
5. P1000 피펫을 사용하여 펠릿을 4mL의 HB에 부드럽게 재현탁합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 500 x g에서 4°C에서 10분 동안 회전합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 3mL의 WM에 재현탁합니다.
6. 15mL 시험관에 35μm 스트레이너 캡을 0.5mL의 WM으로 미리 적십니다. 세포 스트레이너를 통해 2.5단계의 핵 현탁액을 변형시키고 P1000 피펫을 사용하여 한 번에 0.5mL를 부드럽게 피펫팅합니다.
7. 0.5mL의 WM으로 스트레이너 캡을 세척하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 여과액을 새 15mL 튜브로 옮기고 500 x g에서 4°C에서 5분 및 4°C 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠렛을 3mL의 WM에 재현탁합니다.
8. 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다. 상등액을 버리고 마우스 항신경 핵 항원(NeuN), AlexaFluor 488 접합 항체(anti-NeuN-AF488, 1:32,000) 및 1μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)과 함께 1mL의 WM에 펠릿을 재현탁합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.
   메모: 분리된 핵의 면역 염색을 최적화하려면 항체를 적정하여 유세포 분석 및 분류를 위한 최적의 희석을 결정하는 것이 좋습니다. 그런 다음 적절한 대조군을 실행하여 염색 조건이 최적인지 확인합니다. 예를 들어, 접합된 항NeuN-AF488 항체의 경우, 음성 대조군(즉, 항체 추가 없음, 그림 2A)과 양성 대조군(즉, 항체로 염색, 그림 2B)을 실행하여 염색되지 않은 집단과 염색된 집단의 분리를 평가했습니다. AF488 접합 항체로 작업을 시작할 때 특이성을 평가하기 위해 AF488 접합 동형(isotype) 대조군을 실행하는 것이 좋습니다. 비접합 항체를 사용하는 경우, 2차 항체의 비특이적 결합을 평가하기 위해 핵 제제에만 2차 항체를 추가하는 것과 같은 추가 제어가 필요할 수 있습니다.

3. 신경 세포 집단을 제외하기 위한 형광 활성화 핵 분류(FANS) (타이밍: 45분)

1. 면역 염색된 핵 현탁액을 5mL 시험관으로 옮기고 유세포 분석 절차가 시작될 때까지 얼음에 보관합니다.
   메모: 두 개의 마우스 DG보다 더 큰 조직 조각으로 작업하는 경우, 용액의 핵 밀도가 높아지면 형광 활성화 세포 분류기(FACS)가 막히는 것을 방지하기 위해 WM 버퍼를 사용한 추가 희석이 필요할 수 있습니다.
2. 튜브를 FACS 기기에 넣기 전에 저속으로 3초 동안 샘플을 소용돌이칩니다(재료 표 참조).
   참고: (FACS 설정) 분류 기계는 절차를 시작할 때 제조업체의 권장 사항에 따라 보정 입자와 정렬해야 합니다. 드롭 지연은 FACS 모델에 따라 비드 또는 마이크로스피어(재료 표 참조)로 보정되었습니다. 샘플은 순도 모드에서 4°C로 분류되었습니다. 수집 부피를 줄이기 위해 핵을 유세포 분석기에 권장되는 압력에서 70μm 노즐을 통해 분류했습니다. 핵을 50μL의 WM을 함유하는 1.5mL의 낮은 결합 튜브(재료 표 참조)로 분류했습니다. 모든 채취 튜브는 튜브 벽에 핵이 달라붙는 위험을 줄이기 위해 밤새 4°C에서 PBS + 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅되었습니다.
3. 염색된 핵 현탁액의 샘플에서 데이터를 획득하려면 세포 파편과 응집된 핵을 제외하기 위해 게이트를 DAPI 높이와 DAPI 영역으로 설정합니다(그림 3A). 또한, 로그 사이드 산란(SSC) 영역과 로그 전방 산란(FSC) 영역에 게이트를 설정하여 남아 있는 DAPI 염색 응집체 또는 세포 파편에서 단일 핵을 분리합니다(그림 3B).
4. 그림 3C와 같이 anti-NeuN-AF488 및 FSC 영역에 대한 게이트를 설정하여 NeuN-AF488 음성 모집단을 격리합니다.
5. 분석 후 위에서 설명한 게이팅 전략을 사용하여 50μL의 WM.
   로 채워진 1.5mL 수집 튜브에서 NeuN-AF488 음성 모집단을 정렬합니다. 메모: 위에서 설명한 게이팅 전략과 성체 마우스의 뇌에서 DG를 분리하기 위한 해부 절차에 따라 NeuN-AF488 음성 집단은 단일 핵의 ~14%를 나타낼 것으로 예상됩니다.

표 1: 연구에 사용된 미디어 및 버퍼의 구성.

명 의 분 의 개 의 분 호 명 명 세 의 의 명 조 분 명 조 분 명

핵 분리 배지 #1(NIM1) – 4°C에서 최대 6개월 보관
구성 요소	부피(μL)	최종 농도 (mM)
1.5 M 자당	1,833.30	250
1 M KCl	275	25
1 M 마그네슘2	55	5
1M 트리스 버퍼, pH 8.0	110	10
뉴클레아제가 없는 물	8,726.70	-
총 부피	11,000	-
핵 분리 배지 #2(NIM2) – 새로 만들기
구성 요소	부피(μL)	최종 집중
님1	10,769	-
1mM DTT	11	1 μM
100x 프로테아제 억제제	110	1배
트리톤 X-100 10% (v/v)	110	0.1%(V/V)
총 부피	11,000	-
균질화 완충액(HB) – 새로 만들기
구성 요소	부피(μL)	최종 집중
님2	10,958.75	-
RNase 억제제, 40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasin, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
총 부피	11,000	-
워시 미디어 (WM)
구성 요소	부피(μL)	최종 집중
BSA 7.5%	1,466.70	1%
RNase 억제제, 40 U μL-1	27.5	100 U mL-1
RNasin, 40 U μL-1	13.75	50 U mL-1
PBS (PBS)	9,492.05	-
총 부피	11,000	-

결과

그림 1: 비신경세포 집단의 snRNA-seq에 대한 성체 마우스의 절개된 DG에서 단일 핵 현탁액의 준비. snRNA-seq를 진행하기 전에 mouse DG 해부, 단일 핵 현탁액 준비, NeuN 면역염색 및 음성 NeuN-FANS 분류를 포함하는 프로토콜의 주요 단계를 설명하는 흐름도.

그림 2: FANS에 대한 면역염색 검증. 핵 현탁액은 (A) 항-NeuN-AF 488 항체를 음성 대조군으로 사용하지 않고 또는 (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5ml 마이크로튜브	에펜도르프	30124537
10.00μm Flouresbrite YG 카르복실레이트 마이크로스피어	폴리사이언스	15700-10
15mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	코 닝	430052
멸균 Dumont #5 집게 2켤레	정밀 과학 도구	11252-30
4",6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	시그마 알드리치	D9564-10MG
4150 TapeStation 시스템	애질런트	해당 사항 없음
5mL 둥근 바닥 고선명도 폴리프로필렌 시험관(스냅 캡 포함	송골매	352063
5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관(셀 스트레이너 스냅 캡 포함	송골매	352235
50mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	코 닝	430829
70 μm 세포 스트레이너	송골매	352350
8 피크 SPHERO 레인보우 캘리브레이션 입자	BD 바이오사이언스	RCP-30-5ᅡ
Accudrop 비즈	BD 바이오사이언스	해당 사항 없음
Allegra X-30R 원심분리기	벡크만 쿨터	해당 사항 없음
Anti-NeuN 항체, 클론 A60, Alexa Fluor 488 접합	밀리포어	MAB377X
BD FACSaria Fusion 유세포 분석기	BD 바이오사이언스	해당 사항 없음
벡크만 쿨터 MoFlo XDP	벡크만 쿨터	해당 사항 없음
BSA 7.5%	지브코	15260037
디티오트레이톨(DTT)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	R0861
Dounce 티슈 그라인더 세트: 모르타르, 느슨한 절굿공이(A) 및 타이트 절굿공이(B)	킴블	D8938-1세트
Eppendorf Tubes Protein LoBind 1.5ml	에펜도르프	30108116
정지, 100x 프로테아제 억제제	써모피셔	78429
케이클	모든 화학 물질 공급 업체		실험실에서 제작
LUNA-FX7 자동 세포 계수기	로고스 바이오시스템즈	해당 사항 없음
재질 보기 MgCl2	모든 화학 물질 공급 업체		실험실에서 제작
N°10 보호대 멸균 일회용 메스	스완-모튼	6601
뉴클레아제가 없는 물	시그마 알드리치	W4502-1L
멸균 학생 수술 가위 한 쌍	정밀 과학 도구	91401-12
PBS (PBS)	모든 화학 물질 공급 업체		실험실에서 제작
RNase 억제제 40 U μl-1	앰비언	AM2684
RNasin 40 U μl-1	프로메가	N211A
멸균 페트리 접시	코 닝	430167
자당	시그마 알드리치	59378-500지
트리스 버퍼, pH 8.0	모든 화학 물질 공급 업체		실험실에서 제작
트리톤 X-100 10% (v/v)	시그마 알드리치	T8787-250ML
트리판 블루	인비트로젠	T10282

년 년 ) ) ) 년