Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

초록

출처: Zhang, H. et al. 탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 1차 미세아교세포의 분리. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 자기 세포 분류를 사용하여 마우스 뇌의 탈수초 병변에서 미세아교세포를 추출하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 미세아교세포를 포함하는 병변된 뇌 조직을 절개하고, 특정 효소로 조직을 처리하여 단세포 현탁액을 얻고, 미세아교세포 수용체 특이적 자기 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 재료

1. 프로토콜을 시작하기 전에 다음 솔루션을 준비합니다.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 소 태아 혈청(FBS, 2%)을 첨가하여 로딩 버퍼를 준비합니다.
   2. PBS에 중적색(NR) 염료(최종 1%)를 첨가합니다.
2. 시중에서 판매되는 성인 뇌 해리 키트(Adult Brain Dissociation Kit)를 사용하여 다음 솔루션을 준비합니다(재료표 참조).
   1. 효소 혼합물 1을 준비하기 위해 1.9mL의 Buffer Z와 50μL의 Enzyme P를 15mL 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.
   2. 효소 혼합물 2를 준비하기 위해 20μL의 Buffer Y와 10μL의 Enzyme A를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.
   3. 이물질 제거 용액을 준비합니다.

2. 마우스 관류 및 해부

1. 복강내(i.p.) 마취 2-3시간 전에 PBS에 500μL의 1% NR 염료를 마우스에 주입합니다.
   메모: 탈수초성 마우스 모델에서 NR의 복강 내 주사는 병변을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 1).
2. 펜토바르비탈(50mg/kg, i.p.)로 마우스를 마취하고 통증 반응을 검사하여 마우스가 성공적으로 마취되었는지 확인합니다.
3. 마우스의 흉강을 열고 심장을 노출시킵니다.
4. 우심방의 작은 모서리를 조심스럽게 잘라내고 좌심실에서 20-30mL의 차가운 PBS를 마우스에 심내로 관류합니다.
5. 마취 상태에서 마우스의 목을 베십시오.
6. 쥐의 두개골을 열고 두개골에서 뇌를 조심스럽게 빼냅니다.
7. 뇌를 쥐의 뇌 슬라이스 틀에 옮기고 뇌를 0.1cm 슬라이스로 자릅니다.
8. 뇌 조각을 제거하고 페트리 접시(60/15mm)에 담긴 차가운 PBS에 넣습니다. 미세수술 겸자를 사용하여 실체현미경으로 말뭉치 주위의 NR 염료로 표시된 병변을 미세해부합니다.
   메모: 후속 이동을 용이하게 하기 위해 절개된 조직이 가능한 한 완전한지 확인하십시오. 전체 해부 진행은 2시간 이내에 완료되어야 합니다.
9. 절개된 조직을 적절한 양의 냉간 로딩 버퍼가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   메모: 2-3 마리의 쥐에서 corpus callosum 조직을 하나의 샘플로 하나의 튜브에 함께 모으십시오.

3. 조직 해리

1. 절개된 조직을 300×g에서 30초 동안(이 속도에 도달한 후) 원심분리하여 튜브 바닥에서 샘플을 수집합니다.
2. 인큐베이터에서 효소 믹스 1과 2를 37 °C로 예열합니다.
3. 1,950 μL의 예열된 효소를 넣고 1 대 1 샘플로 혼합한 후 37 °C의 인큐베이터에서 5분 동안 분해합니다.
4. 예열된 효소 믹스 2 30μL를 넣고 부드럽게 섞는다.
5. 37°C의 인큐베이터에서 15분 동안 소화하고 5분마다 부드럽게 섞습니다.
6. 소화 후 튜브에 차가운 PBS 4mL를 넣고 부드럽게 흔듭니다.
7. 50mL 원심분리 튜브에 70μm 필터를 놓고 500μL의 차가운 PBS로 필터를 미리 적십니다. 분해된 조직 샘플을 필터를 통과시켜 해리된 조직을 여과하고 50mL 원심분리 튜브의 여과된 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   메모: 조직의 양이 너무 적으면 이 단계를 건너뜁니다.
8. 여과된 조직 샘플을 300 ×g에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 천천히 완전하게 흡인합니다.
   메모: 효소 분해를 제외한 모든 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.

4. 파편 제거

1. 1,550μL의 차가운 PBS로 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
2. 이물질 제거를 위해 450μL의 저온 용액을 넣고 잘 섞습니다.
3. 1,000μL 피펫을 사용하여 위의 혼합물에 2 x 1mL의 차가운 PBS를 천천히 부드럽게 오버레이합니다.
   메모: 원심분리기 튜브를 45° 기울이고 피펫으로 튜브 벽을 따라 PBS를 천천히 추가합니다.
4. 튜브를 천천히 부드럽게 원심분리기에 옮기고 4°C, 3,000×g에서 10분 동안 회전합니다.
5. 원심분리 후 3개의 층을 찾으십시오. 1,000 μL 피펫을 사용하여 두 개의 상단 층을 완전히 흡입합니다(그림 2).
6. 튜브에 최대 5mL의 냉간 로딩 버퍼를 채우고 튜브를 세 번 부드럽게 뒤집습니다.
7. 4°C에서 1,000×g에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 완전히 흡인하고 세포 펠릿을 파괴하지 않도록 합니다.

5. 미세아교세포의 자기분리

1. 세포 펠릿을 90μL의 로딩 버퍼로 재현탁하고 10μL의 CD11b(Microglia) 비드를 추가합니다.
2. 잘 섞어 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.
3. 1mL의 로딩 버퍼를 추가하고 1,000μL 피펫으로 액체를 위아래로 부드럽게 피펫으로 주입하여 배양 후 세포를 세척합니다. 4°C 및 300×g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 상등액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거합니다.
4. 500μL의 로딩 버퍼에 세포를 재현탁합니다.
5. 자기장에서 포지티브 선택을 위해 MS 컬럼을 분리기와 함께 놓습니다.
6. 500μL의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구어 셀을 보호하고 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 분류의 효율성을 보장합니다.
7. 세포 현탁액을 MS 컬럼에 적용하고 라벨링되지 않은 세포가 포함된 플로우스루를 폐기합니다.
8. 500μL의 로딩 버퍼를 컬럼에 세 번 추가하여 컬럼 벽에 부착된 세포를 씻어내고 flowthrough.
   메모: 컬럼 저장소가 비어 있을 때만 세척을 위해 새 로딩 버퍼를 추가하십시오.
9. 컬럼을 세척한 후 분리기에서 컬럼을 제거하고 15mL 원심분리 튜브에 놓습니다.
10. 1mL의 로딩 버퍼를 컬럼에 추가하고 플런저를 바닥으로 밀어 자기적으로 라벨링된 셀을 씻어냅니다. 이 단계를 세 번 반복하여 자기적으로 표지된 세포를 완전히 수집합니다.

결과

그림 1: 중성 적색 염료로 표지된 국소 탈수초 병변의 이미지.

그림 2: 원심분리에 의해 형성된 3개의 층 이미지. 맨 위 두 층(층 1 + 층 2)은 잔해 제거 과정에서 제거해야 합니다(프로토콜 단계 4.5 참조).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	바이오필	CFT001015
15 mL 원심분리기 튜브	바이오필	CFT011150
50 mL 원심분리기 튜브	바이오필	CFT011500
70 μm 필터	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-095-823
성인 뇌 해리 키트, 마우스와 쥐	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-107-677
C57BL/6J 마우스	SJA 연구소
CD11b (Microglia) 비드, 인간 및 마우스	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-093-634
소 태아 세럼	보스터	PYG0001
MACS 멀티스탠드	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-303
MiniMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-102
MS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-201
뉴트럴 레드	시그마-알드리치	1013690025
PBS (PBS)	보스터	PYG0021
펜토바르비탈	시그마-알드리치	P-010
실체현미경	음쉿	엠z62