동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 솔루션 준비
- NGM-한천 플레이트(1L)
- NaCl 3g, 펩톤 배지(예: Bacto-Peptone) 2.5g, 한천 20g을 추가합니다. 오토클레이빙 후 콜레스테롤 1mL(95% 에탄올[EtOH] 스톡 중 5mg/mL), 1M MgSO4 1mL, 1M CaCl2 1mL, 1M K2PO4 25mL 및 암포테리신 B 1mL(2.5mg/mL 스톡)를 추가합니다.
- NGM-한천 RNAi 플레이트(1L)
- NaCl 3g, 펩톤 배지 2.5g, 한천 20g을 추가합니다. 오토클레이브 후 콜레스테롤 1mL(95% EtOH 스톡 중 5mg/mL), 1M MgSO4 1mL, 1M CaCl2 1mL, 1M K2PO4 25mL, 암포테리신 B 1mL(2.5mg/mL 스톡), 1M 이소프로필β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 1mL 및 카르베니실린(50mg/mL)
1mL를 추가합니다.
- 루리아 베르타니(LB)-한천(1L)
- 펩톤 배지 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 20g, 1M Tris pH 8.0 10mL를 추가합니다. H2O를 1L에 첨가합니다. 오토클레이빙 후 50mg/mL 카르베니실린 1mL와 5mg/mL 테트라사이클린 2.5mL를 추가합니다.
- LB 미디엄(1L)
- 펩톤 배지 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 10M Tris pH 1.0 mL를 추가합니다. H2O를 1L에 첨가합니다. 오토클레이빙 후 50mg/mL 카르베니실린 1mL를 첨가합니다.
- M9 버퍼(1L)
- Na2HPO4 6.0g, K2PO4 3g, NaCl 5g 및 젤라틴 50mg을 추가합니다. 사용하기 전에 1M MgSO4 1mL를 첨가하십시오.
- 표백 용액 (10mL)
- NaClO 1mL와 5N NaOH 2mL를 추가합니다. H2O를 10 mL에 첨가합니다.
2. RNAi 플레이트의 준비
참고: 예쁜꼬마선충은 일반적으로 실험실에서 7.5mL의 선충 성장 배지 한천(NGM-Agar)을 포함하는 6cm 페트리 플레이트에서 배양됩니다. 이 프로토콜은 15°C에서 유지되는 웜에 최적화되어 있습니다. NGM으로 플레이트를 준비하려면 표준 멸균 기술을 사용하여 곰팡이 및 박테리아 오염을 방지하십시오. 다음은 RNAi용 시약이 보충된 NGM 플레이트를 제조하는 프로토콜입니다.
- 1mM IPTG 및 50μg/mL 카르베니실린을 함유한 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트를 준비합니다. 어두운 곳에서 실온에서 24 – 48시간 동안 건조시키십시오.
- 어두운 곳에서 RNAi 플레이트를 4°C로 유지하십시오. 14일이 지나지 않은 경우 사용하지 마십시오.
- 3상 줄무늬 패턴을 사용하여 50μg/mL 카르베니실린 및 12.5μg/mL 테트라사이클린을 함유하는 LB-한천 플레이트의 사용 가능한 RNAi 라이브러리13에서 냉동 글리세롤 스톡의 lin-53 유전자 DNA 염기서열과 함께 L4440 플라스미드를 포함하는 RNAi 박테리아(Escherichia coli HT115) 클론을 선택합니다. 박테리아를 37°C에서 밤새 성장시킵니다. 이 클론은 박테리아에서 lin-53 dsRNA의 IPTG 의존적 생산을 가능하게 합니다.
- 또한, 유전자 염기서열 없이 L4440 플라스미드를 포함하는 RNAi 박테리아를 빈 벡터 대조군으로 성장시킵니다.
- 다음 날, 200μL 피펫 팁을 사용하여 lin-53 또는 빈 벡터 LB-한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 50μg/mL 카르베니실린이 보충된 2mL의 액체 LB 배지가 들어 있는 별도의 배양 튜브에 각각을 접종합니다. 600 nm에서 0.6 – 0.8의 광학 밀도(OD)에 도달할 때까지 37°C에서 밤새 배양물을 성장시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 OD를 측정합니다.
주의: 액체 LB 매체에는 글리세롤 스톡에서 박테리아를 제거하는 데 사용되는 LB-한천 플레이트와 달리 테트라사이클린이 포함되어서는 안 되는데, 이는 공급 중에 테트라사이클린을 포함하면 RNAi 효율이 감소하기 때문입니다.
- 멀티피펫을 사용하여 각 박테리아 배양액(lin-53 또는 빈 벡터) 500μL를 6cm NGM-Agar RNAi 플레이트에 추가합니다. 뚜껑을 닫은 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 밤새 배양하여 건조시킵니다. 이 기간 동안 NGM 플레이트의 IPTG는 박테리아에서 dsRNA의 생산을 유도합니다.
- 실험당 박테리아 배양당 최소 3개의 플레이트를 사용합니다. 이렇게 하면 각 실험에 대해 3개의 기술적 재현이 제공됩니다.
- 박테리아가 있는 건조된 NGM-한천 RNAi 플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
3. 예쁜꼬마선충 균주 BAT28의 제조
- 15°C에서 표준 NGM-한천 플레이트를 사용하여 OP50 박테리아에서 전이유전자 otIs305[hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1[gcy-5prom::gfp]를 포함하는 웜 균주 BAT288을 유지합니다.
참고: 선충 배양에 대한 자세한 프로토콜은 다음을 참조하십시오. rol-6(su1006)은 우성 대립유전자이며 일반적으로 사용되는 표현형 주입 마커16로 전형적인 롤링 움직임을 유발합니다. otIs305 전이유전자에서 hsp-16.2prom::che-1을 추적하는 데 사용됩니다.
- HSP-16.2PROM::che-1 전이유전자의 부주의한 활성화를 방지하기 위해 BAT28 균주를 항상 15°C로 유지하십시오. 15°C 이상의 온도에 대한 노출을 줄이면서 변형을 최대한 많이 취급합니다.
- 지렁이의 나이를 동기화하려면 표백 기술을 사용하십시오.
- 900μL M9 완충액을 사용하여 BAT28의 성체와 난자가 들어 있는 6cm NGM-Agar 플레이트를 씻어냅니다. 900 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿 웜을 만듭니다. 상층액을 제거합니다.
- 0.5 – 1mL의 표백 용액을 넣고 성충이 터지기 시작할 때까지 약 1분 동안 튜브를 흔듭니다. 표준 실체현미경을 사용하여 모니터링합니다.
- 900 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿 웜을 제거합니다.
- 800μL의 M9 완충액을 첨가하고 900 x g에서 원심분리하여 웜 펠릿을 3회 세척합니다.
- 세척된 계란을 OP50 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 플레이트에 놓습니다. OP50 박테리아가 L4 단계(약 4일)에 도달할 때까지 15°C에서 표백된 개체군을 성장시킵니다. L4 유충은 표준 실체현미경을 사용하여 기생충18의 복부 쪽을 따라 대략 중간에 있는 흰색 패치로 식별할 수 있습니다.
메모: lin-53이 고갈될 때 생식 세포에서 뉴런으로의 변환 표현형을 달성하려면 부모 세대(P0)에서 고갈되어야 합니다. 변환 표현형에 대한 점수 매기기는 다음 세대(효도 세대 F1)에서 수행됩니다. P0에 이미 있는 고갈된 lin-53을 달성하기 위해 L4 동물은 RNAi를 투여합니다.
- 백금 와이어를 사용하여 복제당 50개의 L4 스테이지 웜을 박테리아가 없는 NGM 플레이트로 수동으로 옮기고 웜이 전이된 OP50 박테리아로부터 멀어지도록 합니다. 약 5분 동안 접시 위에서 벌레를 움직이게 합니다. 이전에 lin-53 RNAi 박테리아(또는 빈 벡터 대조군)가 파종된 NGM-Agar RNAi 플레이트의 박테리아를 사용하여 해당 RNAi 플레이트로 이동합니다.
- OP50 박테리아가 실제 RNAi 플레이트로 이동하지 않도록 합니다. 15°C 이상의 온도에 대한 변형률의 노출 시간을 최소화하기 위해 빠르게 작업하십시오.
- 웜의 F1 자손이 L3 – L4 단계에 도달할 때까지 약 7일 동안 15°C에서 NGM-Agar RNAi 플레이트에서 웜을 배양합니다. 그들은 F1 자손보다 크고 두껍기 때문에 P0 동물과 명확하게 구분 될 수 있습니다.
- 표준 실체현미경으로 F1 자손 웜이 그림 1과 같이 돌출된 외음부(pvul) 표현형을 보이는지 육안으로 확인합니다. lin-53에 대한 RNAi는 pleiotropic 효과를 가지며 lin-53에 대한 RNAi가 성공적이었는지 여부를 평가하는 데 사용할 수 있는 pvul 표현형을 유발합니다.
메모: lin-53에 대한 RNAi도 F1 배아의 치사율을 유발할 수 있습니다. 이 효과는 동물이 L3 – L4 단계에 도달하기 전에 플레이트가 15°C보다 높은 온도에 노출되면 증가합니다. 죽은 배아는 정지된 발달과 부화의 부족으로 인식될 수 있습니다.
- IPTG는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 플레이트를 배양하십시오.
4. 생식세포 재프로그래밍의 유도
- lin-53 및 빈 벡터 RNAi 처리된 F1 자손을 포함하는 검사된 RNAi 플레이트를 어둠 속에서 37°C에서 30분 동안 배양하여 CHE-1을 활성화합니다. 보다 효율적인 열 충격을 허용하므로 통풍 인큐베이터를 사용하십시오.
- 열에 충격을 받은 동물이 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 회복되도록 한 다음 어두운 곳에서 밤새 25°C의 플레이트를 배양합니다.
- 형광 광원에 연결된 표준 실체 현미경을 사용하여 그림 2와 같이 녹색 형광 단백질(GFP) 필터 아래에서 동물을 검사하여 벌레의 중간 몸체 영역에서 gcy-5prom::GFP 파생 신호를 확인합니다. GFP 신호용 세트 현미경: 488nm에서 최대 여기, 509nm에서 최대 방출.
- 한천 패드가 포함된 현미경 슬라이드에서 GFP 신호가 있는 동물을 몸 중간 영역에 장착하여 생식 세포에서 뉴런으로의 변환 정도를 평가합니다.
- 표현형 침투를 평가하기 위해 생식 세포에서 뉴런으로의 전환을 보이는 동물의 수와 어두운 동물의 수를 세십시오. 일반적으로 동물의 약 30%는 lin-53 고갈 시 생식세포에서 이산적인 GFP 신호를 보이는 반면, 5% 이하의 동물은 빈 벡터 RNAi에서 생식세포에서 확산 GFP 신호를 나타냅니다.
