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면책 조항: 검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 뇌와 척수의 기계적 균질화
참고: 이 섹션에서 설명하는 볼륨은 절반의 뇌 또는 척수를 균질화하기에 충분합니다.
- 얼음 위에 놓인 Dounce 티슈 그라인더(Table of Materials)의 유리 모르타르를 미리 식힙니다.
- 모르타르에 미리 냉각된 3x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 1mL를 추가합니다.
- 6웰 플레이트의 웰에서 유리 모르타르로 조직(뇌 또는 척수)을 옮기고 1x HBSS에 담그고 모르타르 바닥에 놓이는지 확인합니다.
- 유봉 A를 10회 치고 유봉 B를 10회 치면서 조직을 부드럽게 부수고 균질화된 혼합물을 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 사전 냉각된 1x HBSS와 원심분리기를 사용하여 4°C에서 320 x g로 10분 동안 튜브를 최종 부피 10mL까지 채웁니다.
- 상등액을 흡인하고 얼음처럼 차가운 1x HBSS를 각 튜브에 최종 부피 7mL까지 첨가하고 볼텍싱을 통해 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
2. 파편 제거
참고: 주로 소화되지 않은 조직과 미엘린 수초로 구성된 파편을 제거하는 것은 후속 유세포 분석을 위해 조직 균질액을 효율적으로 염색할 수 있도록 하는 중요한 단계입니다.
- 70μm 세포 여과기를 통해 각 샘플을 여과하여 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거합니다. 이 단계는 척수 조직으로 작업할 때 특히 중요한데, 이러한 샘플에는 후속 단계에 영향을 줄 수 있는 소화되지 않은 신경 조각이나 수막이 포함될 가능성이 더 높기 때문입니다.
- 각 샘플 튜브에서 최종 부피가 7mL인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 얼음처럼 차가운 1x HBSS를 최대 7mL까지 채웁니다.
- 각 샘플에 3mL의 사전 냉각된 isotonic Percoll 용액(IPS)을 추가하여 30% 최종 농도에서 밀도 구배 매체를 포함하는 용액 10mL의 최종 부피를 만듭니다. 샘플이 균일하게 혼합되도록 샘플을 부드럽게 와류로 가열합니다.
- 18°C에서 700 x g에서 15분 동안 원심분리기 샘플을 추출하고 원심분리기의 가속도를 7로 설정하고 브레이크를 0.
로 설정합니다.
메모: 원심분리는 약 30분 정도 소요됩니다.
- 원심분리기에서 샘플을 섬세하게 제거합니다.
메모: 파편과 미엘린으로 구성된 희끄무레한 원반이 용액 표면에 떠 있는 것을 볼 수 있어야 합니다. 펠릿(관심 세포가 포함됨)이 튜브 바닥에 보여야 합니다.
- 희끄무레한 파편 디스크를 모두 조심스럽게 흡인하고 나머지 상층액을 흡인하여 펠릿이 제거되지 않도록 합니다. 세포 펠릿 위에 약 100μL의 용액을 남겨 두어 실수로 제거될 위험을 방지합니다.
- 1mL의 유세포분석법(FACS) 차단(BL) 용액을 추가하고, 1000μL 피펫 팁으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁하고, 샘플을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 실온(RT)에서 450 x g에서 5분 동안 원심분리기.
- 상층액을 부드럽게 흡인하고 다운스트림 분석과 호환되는 적절한 완충액에 펠릿을 재현탁
합니다.