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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 재료 준비
- MACS(Magnetic-activated Cell Sorting) 완충액: 2mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(재료 표)을 PBS-/-로 준비합니다.
- 콜라겐 분해 효소 IV 원액 (20 U/μL) : 분말을 PBS + / + (재료 표)에 재현탁시키고 분취 및 -20 ° C에서 보관하십시오 .
메모: 콜라겐분해효소 IV는 MgCl2가 완전히 활성화되어야 합니다. 콜라겐분해효소 IV 용액을 동결-해동하지 마십시오.
- 마취 진통제: PBS-/-.
1mL에 케타민 150μL, 자일라진 25μl(5mg/kg) 및 부프레케어(0.1mg/kg) 330μl를 혼합합니다.
메모: 마취 진통제 용액을 즉석에서 준비하고 하루 이상 보관하지 마십시오.
- 헤파린 용액 (100 U/mL) : 분말을 PBS-/-에 재현탁시킵니다.
- 튜브를 PBS-/-로 채워진 디캔터 Erlenmeyer에 연결하는 주입 삽입 시스템을 준비합니다. 23G 바늘을 주입 튜브의 끝에 연결합니다. 주입 삽입물을 열고 튜브에 기포가 없을 때까지 PBS를 작동시킵니다.
- 라이트를 장착한 쌍안 확대경을 준비합니다.
2. C57BL/6 마우스의 하우징
- CP(맥락막신경총) 골수성 또는 T 세포의 분석을 위해 각각 4개의 마우스를 사용하고 4개의 CP(각 외측심실, 제3심실 및 제4심실 CP에서 2개, 총 8개의 마우스)를 풀링합니다. CP를 풀링하지 않으면 풍부하지 않기 때문에 CP에서 희귀 면역 집단을 감지하지 못할 위험이 있습니다.
- 실험하기 전에 최소 7일 동안 쥐가 순응하도록 합니다. 일정한 온도와 습도, 12/12 h 또는 14/10 h light/dark 주기에서 물과 표준 펠릿 사료를 자유롭게 사용하여 마우스를 병원체가 없는 상태로 유지하십시오.
3. PBS 관류 및 뇌 해부
- 각 마우스의 무게를 측정하고 10μL/g의 마취-진통제 혼합 용액(단계 1.3)을 복강내로 주입합니다.
- 효율적인 진통제를 위해 약 30분 정도 기다립니다(마우스 손가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다).
- 마취된 마우스를 박리 지지대에 등을 대고 평평하게 놓고 손바닥을 해부 지지대에 테이프로 붙입니다.
- 집게와 가위로 동물의 피부를 꼬집고 복부, 횡격막, 흉부를 열어 심장을 드러냅니다.
메모: 흉부가 열리면 뇌가 무산소 상태가 된다. 관류의 다음 단계를 정확하고 신속하게 진행해야 합니다.
- 20μL의 100U/mL 헤파린 용액을 좌심실에 직접 주입합니다.
- 가늘게 가위로 우심방을 3mm 이상 절개하여 혈액이 몸 밖으로 흘러나올 수 있도록 합니다.
- 그 직후, 좌심실 끝을 통해 주입관 끝에 놓인 23G 바늘을 삽입합니다.
- 주입 시스템을 최대로 열고 완전한 관류를 기다립니다: 약 6mL/분의 유속으로 23G 바늘을 사용하여 관류가 3분 내에 완료됩니다.
메모: 간과 같은 장기가 균일하게 변색되는 것은 관류 효능을 입증합니다.
- 주입 시스템을 닫고 심실에서 바늘을 제거합니다.
- 마우스의 손바닥에서 테이프를 제거합니다. 마우스를 복부 위치에 놓습니다.
- 집게와 가위로 동물의 피부를 꼬집고 머리 꼭대기에서 눈에서 귀까지 피부를 제거하십시오.
- 가위를 사용하여 먼저 눈 사이의 두개골을 자른 다음 각 눈에서 교근 바로 위의 척수까지 측면으로 자릅니다. 이를 위해 가위의 말단을 사용하고 가위로 뇌가 손상되지 않도록 부드럽게 진행하십시오.
- 눈 사이의 말단에서 집게로 두개골을 엽니다.
- 가위를 사용하여 척수를 자르고 집게로 뇌를 추출한 다음 뇌의 측면에 두 점을 놓고 기울여 얼음처럼 차가운 PBS+/+로 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 CP가 즉시 수집됩니다.
메모: 관류 효능을 확인하기 위해 뇌의 변색 여부를 확인합니다.
4. 뇌에서 맥락막신경총 해부
- 뇌 등쪽을 페트리 접시와 쌍안 확대경의 목표 아래에 위치시킵니다.
- 뇌를 제자리에 유지하기 위해 겸자의 도움으로 다른 집게의 두 끝을 반구 사이의 정중선을 통해 아래로 삽입합니다.
- 겸자를 사용하여 캘로섬과 해마가 있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 외측심실과 제3심실의 일부를 노출시킵니다.
- 측면 CP를 양쪽 끝에서 펄럭이는 측면 심실을 감싸고 있는 긴 베일로 식별합니다. 얇은 집게의 양쪽 끝을 사용하여 측면 CP를 잡습니다.해마의 후방 주름에 의해 숨겨질 수 있는 삼각형 뒤쪽 부분을 수집하도록 주의하십시오.
- 반대쪽 반구의 피질(cortex), 말뭉치(corpus callosum) 및 해마(hippocampus)를 중격에서 멀리 당겨 제3심실 전체와 반대쪽 외측 뇌실을 노출시킵니다.
- 미세한 겸자로 세 번째 CP를 수집하며, 이는 입상 표면 측면을 가진 짧은 구조로 식별할 수 있습니다.
- 다른 측면 CP를 수집합니다.
- 겸자의 양쪽 끝을 소뇌와 중뇌 사이에 삽입합니다. 폰즈와 수질에서 소뇌를 분리하여 제4심실을 노출시킵니다.
- 네 번째 CP를 소뇌와 수질 사이의 측면 오른쪽 끝에서 왼쪽 끝까지 네 번째 뇌실을 정렬하는 입상 표면 측면을 가진 긴 구형 구조로 식별합니다. 가는 집게로 네 번째 CP를 수집합니다.
메모: 겸자의 실란 기반 코팅은 겸자에 CP가 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
- 다른 7개의 마우스 각각에 대해 3.1-4.9단계를 반복합니다. 그 동안, 수집된 CP는 얼음 위에 놓인 튜브에 일시적으로 보관할 수 있습니다.
5. 유세포 분석을 위한 시료 준비
- 절개된 모든 CP가 들어 있는 튜브를 750μL의 PBS+/+.
로 채웁니다.
메모: 튜브에 얇은 겸자로 절개된 CP를 증착하면 소량의 PBS+/+가 생성됩니다. CP 조직의 손실 가능성을 방지하기 위해 기존 부피를 750μL로 완성하는 것이 제거하고 새로운 750μL의 PBS+/+로 교체하는 것보다 낫습니다.
- 400 U/mL.
의 최종 농도를 위해 15 μL의 20 U/μL Collagenase IV 원액(1.2단계 참조)을 추가합니다.
메모: DNAse I(150μg/mL)은 과도한 세포 응집을 방지할 수 있습니다.
- Collagenase IV로 CP를 37°C에서 45분 동안 약한 교반(300RPM)으로 배양합니다.
- CP 해리를 마무리하기 위해 약 10회 정도 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
- CP 튜브를 MACS 완충액으로 1.5mL까지 채우고(레시피 단계 1.1 참조) 콜라겐분해효소 IV 활성을 중지합니다.
메모: 콜라겐 분해 효소 IV 활성은 저온에서 중단되고 혈청 알부민에 의해 억제됩니다.
- 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 1.5mL의 MACS 완충액으로 세포를 세척합니다.
- 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.상층액을 버리고 220μL의 MACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.