Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

초록

출처: Sarkar, S. et al., Purity and Versatility(순도 및 다양성이 향상된 1차 미세아교세포의 빠르고 정제된 CD11b 자기 절연). J. Vis. 특급. (2017년)

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 혼합 신경교 문화의 성장

1. 5.5인치 작동 가위로 1-2일 된 새끼의 목을 빠르게 자르고 머리를 얼음 위의 50mL 튜브에 즉시 넣습니다. 이 참수는 안락사의 한 방식이라는 점에 유의하라.
2. 층류 기류 후드에서 4.5인치 직선 미세 해부 가위를 사용하여 두개골과 수막을 작게 절개합니다. 꼬리 끝에서 꼬리 끝(코)까지 절단을 시작합니다. 참수로 형성된 구멍을 사용하여 피부 아래로 들어가십시오.
   1. 절개 후 반구 중 하나를 옆으로 떼어냅니다. 그런 다음 구부러지거나 구부러진 핀셋을 사용하여 뇌 전체를 제거합니다.
3. 37°C 수조에서 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 함유된 새로운 50mL 튜브에 뇌를 15분 동안 담그십시오. 뇌당 2mL의 트립신-EDTA를 사용하십시오.
4. 배지를 추가하거나 제거하여 신선한 성장 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 둘베코의 변형 독수리 배지/영양소 혼합물 F12(DMEM/F12), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 1% 피루브산 나트륨 및 1% 비필수 아미노산)으로 뇌를 세척합니다. 이 작업을 4번 반복합니다.
5. 각 뇌에 성장 배지가 들어 있는 T-75 플라스크 2개를 플레이트합니다. 따라서 뇌당 2mL의 성장 배지를 튜브에 추가합니다. 따라서 T-75 플라스크당 8-9mL의 성장 배지를 가진 1mL의 균질화된 뇌와 동일합니다.
6. 가장 큰 것부터 가장 작은 것까지 다양한 구경 크기의 피펫으로 뇌를 tritureation하여 균질화합니다. 뇌 조직이 작아지지 않는 것이 보이면 다음 파이펫으로 전환합니다. 트리추레이션이 끝나면 현탁액이 투명하고 눈에 보이는 덩어리가 없어야 합니다.
   1. 25mL 피펫, 5mL 피펫, 10mL 피펫을 차례로 사용합니다.
7. 균질한 각 뇌 현탁액을 70μm 세포 여과기에 통과시켜 단일 세포 배양으로 만듭니다.
8. 균질화된 각 뇌에 대해 1.5단계(T-75 플라스크당 8-9mL의 성장 배지가 있는 균질화된 뇌 1mL)에 설명된 대로 성장 배지를 포함하는 두 개의 T-75 플라스크를 플레이트에 넣습니다.
9. 6일 후에 성장 배지를 변경하고 16일 격리될 때까지 성장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12 (1:1) (1배)	생명 기술	11330057
나트륨 피루브산	생명 기술	11360070
MEM 비필수 아미노산(100배)	생명 기술	11140050
L-글루타민(100x)	생명 기술	25030081
에디타	피셔 사이언티픽	AM9260G
소 태아 세럼	시그마	AN-번호 13H469
0.25% 트립신-EDTA	Life Technologies의 Gibco	25200

년