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1. 미세아교세포 분화
참고: 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 요약되어 있습니다.
- 유도만능줄기세포(iPSC) 배양
메모: iPSC 배양 기술에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 확인할 수 있습니다.
- 해동 및 유지 보수
- iPSC 배지를 준비하고 분취한 후 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 부분 표본을 4 °C에서 밤새 해동하고 최대 1주일 동안 사용합니다. 사용하기 전에 미디어를 최소 1시간 동안 주변 온도로 두십시오.
- 칼슘과 마그네슘을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 희석된 10μg/mL의 라미닌 521 1mL를 추가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 최소 2시간 동안 또는 가급적이면 밤새 보관하십시오. 일단 희석되면 라미닌을 4°C에서 3개월 동안 보관하십시오.
- 멸균수에 희석하여 10mM Rho kinase inhibitor Y27632(ROCK Inhibitor) 원액을 준비합니다. ROCK 억제제 용액의 일회용 부분 표본을 만들고 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
- 0.5M EDTA의 원액을 DPBS로 희석하여 0.5mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 준비합니다.
- 얼어붙은 iPSC 바이알을 해동하려면 바이알이 거의 해동될 때까지 37°C의 수조에 넣습니다. 바이알의 내용물을 4mL의 iPSC 배지가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브로 즉시 옮깁니다. 500 × g에서 1분 동안 원심분리기
.
- 상층액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 포함된 iPSC 배지 1mL를 튜브 벽에 천천히 첨가하여 집락을 방해하지 않도록 세포를 재현탁합니다.
- 코팅된 각 웰에 10μM ROCK 억제제를 함유한 iPSC 배지 1.5mL를 추가하고 재현탁 콜로니를 배지가 포함된 웰로 한 방울씩 옮깁니다.
메모: 배양 유지를 위해 1.1.1.6단계에서 5-7방울을 사용하되 모든 iPSC 라인에 대해 최적의 파스딩 밀도를 조정합니다.
- 플레이트를 좌우로, 뒤에서 앞으로 수동으로 섞어 웰의 세포를 고르게 분배합니다. 세포를 37 ° C 및 5 % CO2의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, ROCK 억제제가 없는 새로운 iPSC 배지를 추가하여 배지를 완전히 교체합니다.
- 유지 관리를 위해 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.
메모: 사용된 iPSC 배지가 유연한 공급 일정을 허용하는 경우 배지를 변경하지 않고 2일 동안 세포를 유지할 수 있습니다. 이를 계대당 한 번으로 제한하는 것이 좋으며 세포의 융합도가 50% 미만인 경우에만 가능합니다.
- 분할
- 배지를 흡인하고 1mL의 DPBS(칼슘 및 마그네슘 제외)로 세포를 세척합니다.
- 세포를 제거하려면, 0.5mM EDTA 1mL를 첨가하고 세포 군집의 가장자리가 웰 표면에서 들어 올려질 때까지 실온에서 2-3분 동안 배양합니다. DPBS로 세포를 다시 세척하고 iPSC 배지 1mL를 추가합니다.
- 세포 리프터를 사용하여 세포 군체를 부드럽게 긁어 세포 군체를 해리합니다. 군체를 방해하지 않도록 우물의 각 영역을 한 번만 긁어내십시오.
메모: 우물에서 군체를 제거하는 대체 방법은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
- 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 채취하여 1.5mL의 iPSC 배지가 들어 있는 사전 코팅된 웰(단계 1.1.1.2에서 언급)로 한 방울씩 옮깁니다.
2. 미세아교세포(iMG)에 대한 iPSC 분화
참고: 소분자와 성장 인자는 DPBS의 멸균 여과된 0.1% 소 혈청 알부민에 용해되어 최종 농도보다 1,000배 높은 스톡 농도로 용해됩니다. 초기 계대 동안 iPSC를 iMG로 구별하는 것이 좋습니다. iPSC 라인의 일상적인 핵형 분석이 권장됩니다.
- 표준 코팅 용액 준비
- 세포외 기질 코팅 시약의 원액을 4°C의 얼음에서 하룻밤 동안 해동합니다.
- 마이크로 원심분리기 튜브와 필터 피펫 팁을 4°C에서 사전 냉각합니다.
- 농축된 세포외 매트릭스 코팅 시약 250μL를 각 튜브에 분취하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 부분 표본을 -20 °C에서 보관하십시오.
- 코팅 용액을 준비하려면 세포외 기질 코팅 시약 중 하나를 얼음 위에서 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포(DMEM-F12라고 함) 배지의 성장에 최적화된 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Nutrient 혼합물 F12(DMEM-F12) 50mL를 미리 냉각된 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
- 얼음처럼 차가운 DMEM-F12를 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 1mL 피펫 팁을 식힌 다음 즉시 피펫 팁을 사용하여 250μL의 세포외 매트릭스 코팅 시약을 DMEM-F12 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 표준 코팅 용액은 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.
- 배아체(EB) 형성
- 최대 4일 동안 4°C에서 유지할 수 있는 EB 배지를 준비합니다.
- iPSC가 80% 포화도에 도달하면 1mL의 DPBS로 세척하고 1mL의 해리 시약을 37°C에서 2분 동안 첨가하여 콜로니를 해리합니다. 세포 리프터를 사용하여 여러 번 긁어 단일 세포 현탁액을 만들어 콜로니를 제거합니다. 세포를 모으고 9mL의 DPBS가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 모든 것을 옮깁니다.
- 500 × g에서 1분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거한 후, 1mL의 EB 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포 10μL를 Trypan blue로 1:1로 희석합니다. 혈구계로 세포를 계수하고 세포 수에 따라 세포 스톡을 100μL당 10,000개의 세포로 최종 희석합니다. 도금 셀의 경우, 웰당 100 μL의 희석된 셀을 접착력이 낮은 둥근 바닥의 96웰 플레이트에 추가합니다.
메모: 일반적으로 96웰 플레이트의 48웰은 iPSC의 각 80% 합류 웰에서 얻을 수 있습니다.
- 플레이트를 125 × g에서 3분 동안 원심분리하고 37°C 및 5% CO2에서 4일 동안 배양합니다. 2일차에 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 오래된 배지를 조심스럽게 채취한 다음 50μL의 새로운 EB 배지를 다시 추가하여 절반 중간 변화를 수행합니다.
메모: 4일차에는 iPSC가 결과 섹션에 설명된 대로 EB라고 하는 구형 세포 구조를 형성합니다. 필요한 경우 EB 차별화 프로세스를 최대 7일까지 연장할 수 있습니다.
- 원시 대식세포 전구체(PMP) 생성
- PMP 기본 배지, 멸균 필터를 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
- 1mL의 얼음처럼 차가운 Matrigel 코팅 용액을 첨가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅하고 37°C 및 5% CO2에서 최소 2시간 동안 또는 가급적이면 하룻밤 동안 배양합니다.
- EB 분화 4일차에 1mL 피펫 팁으로 EB를 수집하여(피펫 사용) EB를 Matrigel로 코팅된 웰로 옮깁니다. 우물에서 EB를 제거하기 위해 한두 번 위아래로 피펫팅합니다. EB가 우물 가장자리에 정착할 수 있도록 6웰 플레이트를 기울어진 각도로 잡습니다.
메모: 코팅된 웰당 9개 또는 10개의 EB를 도금할 수 있습니다.
- 모든 EB가 안정되면 EB를 웰 가장자리에 유지하면서 1mL 피펫 팁을 사용하여 오래된 배지를 부드럽게 피펫하고 제거합니다. 각 웰에 갓 준비한 PMP 완전 배지 3mL를 추가합니다. 플레이트를 좌우로, 뒤에서 앞으로 수동으로 섞어 웰의 세포를 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 놓습니다.
- EB가 우물 바닥에 부착될 수 있도록 7일 동안 플레이트를 방해하지 마십시오. 이 시간이 지나면 PMP 완전 매체를 사용하여 절반 중간 변경을 수행합니다.
메모: 이 시점에서 대부분의 EB는 플레이트에 부착되어야 합니다. 모든 유동 EB를 제거할 수 있습니다.
- 5-7일 후, 4배 배율의 광필드 현미경으로 EB를 검사하여 우물 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 1.2.3.5에 설명된 대로 매체를 변경합니다. 21일째에 PMP 완전 배지 3mL로 완전한 배지 변경을 수행합니다.
메모: 매질에 떠 있는 골수성 전구세포는 이 시점에서 분명할 수 있습니다. 이러한 세포는 매체 변경 중에 버려야 합니다.
- 28일째에 상등액에서 PMP라고 하는 둥근 세포를 찾고 10mL 피펫과 자동 피펫터를 사용하여 PMP가 포함된 배지를 수집합니다. EB를 방해하지 않도록 주의하십시오. PMP와 배지를 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 1.2.4단계에 설명된 대로 진행합니다.
메모: 일반적으로 동일한 iPSC 라인의 PMP는 6웰 플레이트의 5개 웰에서 수집하여 단일 15mL 코니컬 튜브에 함께 모을 수 있습니다.
- EB의 추가 유지 관리를 위해 3mL의 새로운 PMP 완전 배지를 추가합니다. PMP가 3개월 이상 EB에서 지속적으로 발생하므로 1.2.3.7 및 1.2.3.8.
단계에 설명된 대로 4-7일마다 PMP를 수집합니다(매체가 노란색 톤으로 색상을 변경하지 않도록 함).
메모: PMP는 몇 달 동안 수집할 수 있지만 시간이 지남에 따라 표현형이 변할 수 있습니다.
- iMG와의 차별화
- iMG 기본 배지(Table of Materials), 멸균 필터를 준비하고 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다.
- PMP를 15mL 코니컬 튜브에 모은 후 200 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 상등액 을 흡인하고 1-2mL의 iMG 기저 배지를 사용하여 PMP를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 작은 부분 표본을 취하고 Trypan blue.
로 1:1로 희석하여 세포를 계산합니다.
참고: 0.5-1.5 × 106 PMP는 일반적으로 iPSC 라인과 EB 배양 연령에 따라 매주 얻습니다.
- 나머지 세포를 다시 200 × g에서 4분 동안 원심분리합니다.PMP를 원하는 농도로 희석하여 세포가 새로 준비된 iMG complete 배지를 사용하여 세포 배양 처리된 플레이트에서 ~105/cm2의 밀도로 플레이팅되도록 합니다. 말단 분화를 위해 10-12일 동안 3-4일마다 갓 준비된 iMG 완전 배지를 사용하여 반 배지 변화를 수행합니다.
메모: 이 시점에서 세포는 미세아교세포와 같은 형태를 획득해야 합니다. 미세아교세포에 대한 PMP의 헌신을 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 퓨린성 수용체 P2RY12 및 막관통 단백질 119(TMEM119)와 같은 미세아교세포가 풍부한 마커의 발현을 확 증합니다.
- 세포의 건강과 생존력을 보존하기 위해 iMG 분화 10일에서 12일 사이에 모든 실험을 수행합니다.
