마우스 망막에서 얻은 Müller Glial 세포 배양 확립

초록

출처: Kang, S., et al. MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 가능성을 연구하기 위한 기본 세포 배양. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 쥐의 망막에서 분리된 Müller glial (MG) 세포의 배양을 보여줍니다. 망막은 소화 효소를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 세포는 MG 세포 증식과 신경 세포 사멸을 촉진하는 성장 인자를 가진 배지에서 성장합니다. 파시에이징(passaging) 과정에서 죽은 신경세포를 제거하고 MG 세포를 성장시켜 추가 분석을 진행합니다.

프로토콜

면책 조항: 검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 망막 해리

참고: (세포 수확까지의) 다음 모든 단계는 A2 또는 B2 생물 안전 작업대(BSC)에서 수행해야 합니다.

1. 다음과 같이 Papain/DNase I 해리 혼합물을 준비합니다.
   1. 6개의 망막의 경우, 750μL의 파파인이 들어 있는 튜브에 75μL의 DNase I을 추가하고 조심스럽게 혼합합니다(해리 혼합물).
   2. 이 프로토콜에 필요한 개별 시료 전처리의 경우, 총 825 μL의 부피를 3개의 부분 표본으로 나눕니다: 마우스당 1개의 1.5 mL 튜브(2개의 망막)에 275 μL의 혼합물을 담습니다. 그에 따라 DNase I 및 Papain의 필요한 양을 계산합니다.
      메모: 최대 6개의 망막이 Papain/DNase I 혼합물의 한 튜브에서 해리될 수 있습니다. 그러나 개별 시료 전처리는 결합된 시료보다 덩어리가 적고 세포 성장이 더 우수합니다.
2. 두 개의 망막을 Papain/DNase I 해리 혼합물로 이식합니다. 팁 직경이 확대된 전사 피펫을 사용하여 망막을 집어 올리고 망막이 팁 바닥에 안착할 때까지 기다린 다음 과도한 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)이 없는 망막을 Papain/DNase I 혼합물이 들어 있는 튜브로 방출합니다.
3. 너트레이터에 놓고 세포 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂)에서 10분 동안 배양합니다.
4. 1mL 피펫으로 조심스럽게 위아래로(약 20-30회) 피펫팅하여 세포를 해리합니다. 세포가 해리된 후(즉, 덩어리가 없는 균질한 용액이 생성된 경우) Papain Dissociation Kit에서 275μL의 Ovomucoid protease 억제제를 첨가하여 Papain을 중화합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 참고: 825 μL의 Papain/DNase I 혼합물에서 6개의 망막이 해리된 경우 825 μL의 Ovomucoid가 필요합니다.
5. 혼합물을 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
6. 37°C에서 예열된 계산된 성장 배지 부피(마우스당 1mL)에 표피 성장 인자(EGF, 성장 배지 1mL당 1μL, PBS에서 200μg/mL로 재구성)를 추가합니다<> 참고: 실험 설계에 따라 증식 마커 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 및 4-Hydroxytamoxifen(4-OHT) 또는 기타 필요한 인자를 배양 기간 초기에 추가할 수 있습니다.
7. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 튜브 바닥에 있는 펠릿을 만지지 마십시오.
8. 상층액을 조심스럽게 완전히 제거하십시오. 세포 펠릿을 500μL의 EGF 보충 성장 배지로 재현탁합니다.
9. 세포 현탁액을 표지된 12웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다(그림 1C). EGF가 보충된 성장 배지 500μL로 튜브를 헹구고 웰에 추가합니다(웰당 총 부피 1mL).
10. 다른 모든 샘플에 대해 1.8 및 1.9단계를 반복합니다.
11. 우물 접시를 조심스럽게 세 번 흔듭니다(앞뒤, 왼쪽, 오른쪽). 플레이트를 인큐베이터(37°C, CO₂)에 넣습니다.
    메모: 형질전환 마우스를 사용하는 경우 모든 동물에 대해 유전형 분석을 수행합니다(그림 1D). Cre recombinase positive 및 negative 마우스를 식별하고 그에 따라 플레이트에 레이블을 지정합니다. 이 프로토콜의 경우 Cre recombinase positive reporter 마우스의 세포만 다음 단계에 사용했습니다. Cre 음성 표본의 세포는 동결되어 다른 응용 분야에 사용됩니다.

2. 성장 단계

참고: 성장 단계는 약 4-5일 동안 지속됩니다(그림 2B). 세포가 들어 있는 웰에 액체를 추가하려면 피펫이 웰의 벽을 가리켜야 하고 액체가 세포가 분리되지 않도록 천천히 방출해야 합니다. 세포 위에 직접 피펫팅하지 마십시오.

1. 해리 하루 후 배지를 제거하고 신선한 EGF 보충 성장 배지 1mL를 추가합니다.
2. 3일차에 배지를 제거하고 HBSS(실온) 1mL를 추가하여 세포 파편을 제거합니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 앞뒤로 흔듭니다. HBSS를 제거하고 세척 단계를 반복한 다음 예열된 EGF 보충 성장 배지 1mL를 추가합니다.
3. 매일 세포를 모니터링하고 세포가 90%-100% 농도에 도달할 때까지 성장 상태를 평가합니다. 그림 3은 시간 경과에 따른 양호한 MG 성장의 예를 보여줍니다. 오염 또는 세포 사멸 가능성을 확인하십시오. 오염된 배양물을 폐기합니다.
   메모: 세포 상태를 모니터링하고 기록하려면 카메라가 부착된 광학 현미경과 4x, 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용하여 다양한 배율로 이미지를 촬영합니다. 이 연구에서는 형광 현미경을 사용합니다.

3. poly-L-ornithine (Poly-O) 및 Laminin coat를 사용한 커버 슬립 준비

참고: 이 단계는 면역형광 라벨링 및 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사를 수행하는 경우에만 필요합니다. 적절한 이미징을 위해서는 원형 유리 커버슬립(직경 12mm)이 필요합니다. 코팅 프로토콜은 뉴런 배지 데이터시트에서도 찾을 수 있습니다(Table of Materials(재료 표 참조).

1. 멸균 Dumont #2AP 겸자를 사용하여 24웰 플레이트의 모든 웰 중앙에 멸균 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
   메모: 우물 중앙에 커버 슬립을 놓습니다. 우물 벽 가까이에 커버슬립을 배치하면 다음 단계에서 표면 장력 문제가 발생합니다.
2. 2.5mL Poly-O 부분 표본을 실온에서 해동하고 100μL를 각 커버슬립 중앙에 놓습니다.
3. 웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
4. Poly-O를 제거하고 ~1mL의 멸균수로 커버슬립으로 웰을 세 번 씻습니다.
5. BSC에서 웰 플레이트를 밤새 건조시킵니다. 2.5mL의 라미닌을 4°C에서 밤새 해동합니다.
6. 다음 날 아침, 각 커버슬립 중앙에 100μL의 라미닌을 추가하고 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.
7. 라미닌을 조심스럽게 완전히 제거하십시오.
8. 즉시 통과 분석을 수행할 수 없는 경우 플레이트를 4°C로 유지하십시오.
   메모: 준비된 플레이트에 코팅된 커버슬립은 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.

4. 신경 세포 생존자를 제거하는 세포 통로

참고: 세포 통로는 세포 개체군을 증가시키는 것이 아니라 신경 세포를 제거하는 데 필요합니다. 신경교세포는 몇 번만 분열하며 통과 후에는 더 이상 성장하지 않습니다. 세포 현탁액을 희석하지 마십시오. 12-웰 플레이트의 한 합류 웰의 셀은 12-웰 플레이트의 1 웰 또는 24-웰 플레이트의 2 웰에 분포될 수 있습니다. 코팅된 커버슬립을 사용하는 경우 커버슬립의 약 1/3만 코팅됩니다. 따라서 24웰 플레이트에 있는 6개의 커버슬립은 12웰 플레이트의 합류 셀의 1웰에서 융합 세포(~80%-90%)를 얻을 수 있습니다. 세포 밀도를 높이거나 낮추기 위해 다른 비율도 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 1개의 Cre+ 리포터 마우스가 사용됩니다[1개 실험, 2개 처리: miR-25 또는 control-miR; 기술적 반복 n = 3(처리당 3개의 커버슬립), 생물학적 복제 n = 1]. 기술적 복제물과 생물학적 복제물의 수는 실험 설계에 따라 다르게 정의할 수 있습니다.

1. 세포가 90%-100% 합류하는지 확인하십시오(또한 우물의 가장자리에서; 그림 3E,F).
2. 배지를 제거하고 HBSS(실온) 1mL를 첨가하여 세척합니다. 접시를 부드럽게 흔듭니다(앞뒤, 왼쪽과 오른쪽). HBSS를 완전히 제거합니다.
3. 500μL의 예열된 트립신 함유 용액(금속 비드 수조에서 37°C로 예열)을 추가하여 웰에서 세포를 분리합니다. 부드럽게 흔들고(앞뒤로, 왼쪽에서 오른쪽으로) 37°C 인큐베이터에서 2분 동안 배양합니다.
4. 플레이트를 인큐베이터에서 BSC로 옮깁니다. 기울이는 동안 트립신 함유 용액을 흡인하고 세포가 완전히 분리될 때까지 웰 위에 조심스럽게 천천히 여러 번 분산시킵니다. 플레이트를 조명에 대고 바닥에 셀이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
5. 이 세포 현탁액을 멸균 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 300 x g에서 4°C에서 8분간 원심분리기.
6. 상층액을 제거하고 600 μL(6 웰/커버슬립의 경우 웰당 100 μL)의 예열된 성장 배지(EGF 보충, 1:1000)를 추가하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 및 위아래로 피펫팅 ~30-40회.
   메모: 이때 세포는 -80°C 또는 액체 질소에서 동결하고 세포주 해동을 위한 표준 프로토콜에 따라 해동할 수 있습니다. 세포가 동결되면 EGF가 보충된 배지(성장 배지)에 재현탁되지 않습니다. 그들은 염기성 매체 (EGF 없음) 및 동결 용액 (1/1 비율)에 재현탁됩니다.
7. 600μL 세포/배지 현탁액 100μL를 24웰 플레이트의 코팅된 커버슬립 6개(단계 5 참조)의 중앙에 배치하여 시드 세포를 생성합니다. 플레이트를 인큐베이터에 조심스럽게 놓고 세포가 가라앉도록 합니다.
   참고: 600μL 세포 현탁액 중 100μL(12웰 플레이트의 한 웰에서 수확)는 transfection에 필요한 90%-100% 세포 포화도를 초래합니다.
8. 3시간 후에 셀을 확인하여 커버슬립에 정착했는지 확인합니다. EGF.
   가 보충된 400μL의 성장 배지를 추가합니다. 참고: 세포는 일반적으로 다음 날에 transfection할 준비가 됩니다(그림 3G). 합류하지 않으면(90%-100%) 다른 날로 두십시오. 그래도 합류하지 않으면 transfection에 사용하지 마십시오. miRNA 프로파일링, RNA-Seq, RT-qPCR 또는 웨스턴 블롯과 같은 다른 다운스트림 응용 분야를 수행하는 경우 세포를 12웰 플레이트(1:1 비율, 플레이트 처리 필요 없음)로 배양하고 RNA/단백질 추출을 위해 수확해야 합니다.

결과

그림 1 : 망막 해리 및 유전형 분석(retinal dissociation and genotyping). (A) 각막, 수정체, 홍채, 유리체가 제거된 아이컵. (B) 고립된 망막; 망막 색소 상피(RPE) 세포는 철저한 세척 후 제거됩니다. (C) 해리된 망막이 있는 12웰 플레이트(웰당 2개의 망막). (D) 유전형 분석 겔 이미지 예시의 컷아웃. Ascl1 유도 Cre 재조합효소 발현을 가진 마우스를 식별하기 위해 유전형 분석이 필요하며 세포 전환을 추적하는 데 사용됩니다. 스케일 바: 1mm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마리
Ascl1-CreERT 마우스 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	잭스 연구소	#012882	Ascl1-CreERT 마우스와 tdTomato 마우스를 교배했습니다
td토마토-STOPfl/fl 마우스 B6. Cg-Gt(ROSA):26Sortm14(CAG-td토마토)Hze/J	잭스 연구소	#007914	Ascl1CreER 양성 마우스를 식별하기 위해 유전형 분석이 필요합니다.
시약
폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드	시그마-알드리치	P4538-50MG	멸균된 물, 냉동 분취액에서 재구성
N-2 보충제	피셔 사이언티픽	Tel.: 17-502-048	냉동 부분 표본
Neurobasal 배지	피셔 사이언티픽	Tel.: 21-103-049	섹션 1.1에서 성장 배지로 사용, 4 °C에서 보관
파파인 해리 시스템	워딩턴 생화학	LK003153	Earle's Balanced Salt Solution, 냉동 부분 표본으로 재구성
페니실린 스트렙토마이신	피셔 사이언티픽	15-140-122	냉동 부분 표본
L-글루타민	피셔 사이언티픽	Tel.: 25-030-081	냉동 부분 표본
HBSS (하이브에스)	피셔 사이언티픽	Tel.: 14-025-134	4 °C에서 보관
소 태아 세럼(FBS)	피셔 사이언티픽	MT35010CV	냉동 부분 표본
플라스틱 제품/소모품
0.6mL 마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	50-408-120
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	Tel.: 50-408-129
10 μL TIP 멸균 필터 피펫 팁	피셔 사이언티픽	전화: 02-707-439
100 μL TIP 멸균 필터 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-431
1000 μL TIP 멸균 필터 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-404
2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브	피셔 사이언티픽	전화: 50-408-138
20 μL TIP 멸균 필터 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-432
조절 가능한 부피 피펫(2.5, 10, 20, 100, 200 및 1000 μL)	에펜도르프	2231300008
일회용 전송 피펫	피셔 사이언티픽	제13-669-12
뚜껑이 있는 Multiwell Flat-Bottom Plate, No. of Wells=12	피셔 사이언티픽	08-772-29
뚜껑이 있는 Multiwell Flat-Bottom Plate, Wells=24	피셔 사이언티픽	08-772-1
PIPET 멸균 필터 10ML 일회용 혈청학 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10J
PIPET 멸균 필터 50ML 일회용 혈청 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10큐
PIPET 멸균 필터 5ML 일회용 혈청학 피펫	피셔 사이언티픽	13-676-10시간
파우더 프리 니트릴 시험 장갑	피셔 사이언티픽	19-130-1597B
원형 커버 슬립 (직경 12mm, 두께 0.17-0.25mm)	피셔 사이언티픽	22293232
진공 필터, 기공 크기=0.22 μm	피셔 사이언티픽	09-761-106
설비
1300 B2 생물 안전 캐비닛	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	1310
올인원 형광 현미경 Keyence BZ-X 810	키엔스	9011800000
Binocular 급상승 입체 음향 현미경	비전 사이언티픽	VS-1EZ-IFR07
일회용 페트리 접시 (직경 100mm)	폭스바겐	제25384-088
Dumont #5 집게 - 생물학/티타늄	정밀 과학 도구	11252-40
Dumont #55 집게 - Biologie/Inox	정밀 과학 도구	11255-20
Dumont #7 커브드 펜치 - 바이오로지/티타늄	정밀 과학 도구	11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R	에펜도르프	2231000508
워터 재킷 CO2 인큐베이터	폭스바겐	제10810-744

. 호 수 ) 년 호 년 년 년 호