형광 활성화 핵 분류를 사용하여 뇌 조직에서 세포 집단 분리

Abstract

출처: Mussa, Z., et al. 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질에서 성인 인간 성상 세포 집단의 분리. J. Vis. 특급 (2021년)

이 동영상은 다양한 신경학적 응용을 위해 다양한 세포 집단을 연구할 수 있는 FANS(Fluorescence-activated nuclei sorting)를 사용하여 갓 냉동된 인간 뇌 조직에서 핵을 분리 및 분류하는 절차를 보여줍니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 버퍼 준비

참고: 다운스트림 RNA 염기서열분석을 수행하는 경우 mRNA 분해를 방지하기 위해 RNase Decontamination Solution으로 모든 작업 공간과 도구를 철저히 처리하십시오.

1. 용해 완충액을 준비합니다.
   1. 다음을 최대 50mL의 증류수 (H₂O)에 용해시킵니다 : 5.47g의 자당 (0.32 M 최종), 250 μL의 1 M 염화칼슘 (CaCl₂) (5 mM 최종), 1 M 마그네슘 아세테이트 150 μL (Mg (CH₃COO) ₂) (3 mM 최종), 10 μL의 500 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (0.1 mM 최종), 1M 트리스 - 염산 (Tris-HCl) (pH 8) (10mM 최종) 500 μL, 트리톤 X-100 50 μL (0.1 % 최종) 및 3 M 디티오 트레이톨 17 μL (DTT, 1 mM 최종, 신선 추가) (재료 표 참조).
2. 자당 완충액 준비
   1. 다음을 증류 된 H₂O에 최대 50 mL까지 용해 : 30.78 g의 자당 (1.8 M 최종), 1 M Mg (CH₃COO) ₂ (3 mM 최종)의 150 μL, 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM 최종)의 500 μL, 3 M DTT 17 μL (1 mM 최종, 신선하게 추가).

2. 동결 조직을 단일 핵 현탁액으로 해리

1. 7mL 유리 티슈 도운서(그라인더)에 얼음처럼 차가운 용해 완충액 4mL를 넣고 얼음에 보관합니다. 갓 냉동된 인간 성인 피질 약 200-400mg을 절개하고 약 50배 분량한 다음 조직 균질액을 12mL 초원심분리기 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
2. 5mL 피펫을 사용하여 6.5mL의 얼음처럼 차가운 자당 완충액을 초원심분리 튜브의 바닥에 추가하고 자당과 조직 균질화 사이의 층을 방해하지 않도록 주의합니다.
   참고: 추가 샘플을 처리하는 경우 더 가벼운 샘플에 추가 용해 버퍼를 추가하여 무게에 따라 튜브의 균형을 조심스럽게 맞춥니다. 초원심분리기 튜브의 정확한 밸런싱은 로터의 손상을 방지하고 적절한 속도로 회전을 보장하는 데 필수적입니다.

3. 초원심분리

1. 24,400rpm(101,814 × g)에서 4°C에서 1시간 동안 용해물을 초원심분리합니다.펠릿을 방해하지 않고 상등액과 파편을 조심스럽게 흡인합니다.
   메모: 200mg 미만의 조직으로 시작하는 경우 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다.
2. 600μL의 인산염 완충 식염수(PBS)(칼슘(Ca²⁺), 마그네슘(Mg²⁺) 무함유)를 핵 펠릿에 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양한 후 재현탁합니다.
3. 핵 펠릿을 얼음 위에 재현탁시키기 위해 위아래로 50회 피펫팅합니다.
4. 혈구계를 사용하여 현미경으로 온전한 핵을 시각화하고 다음 단계로 진행하기 전에 재부유액의 농도가 10⁵ nuclei/mL 이상인지 확인합니다(재현탁된 핵 10 μL와 트리판 블루 10 μL 결합).

4. 항체 배양

1. 형광 활성화 핵 분류(FANS)를 위해 샘플에 면역태그를 추가하려면 재현탁 샘플 펠릿 500μL, 1x PBS(Ca²⁺, Mg²⁺ free) 490μL, 10% 소 혈청 알부민(BSA) 10μL(0.1% 최종), AF(Alexa fluor)555(NeuN-AF555, 1:1000 최종 농도)에 접합된 마우스 항NeuN 항체 1μL를 추가합니다. 및 알로피코시아닌(PAX6-APC, 1:1000 최종 농도)에 접합된 마우스 항-PAX6 항체 1μL.
   메모: 다른 형광단에 접합된 대체 항체를 첨가할 수 있습니다. 여기서, AF488(1:1000 농도)에 접합된 마우스 anti-OLIG2를 사용하여 유리한 결과를 얻었습니다.
2. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 전용 및 단색 제어를 수행하여 필요에 따라 소량의 샘플을 사용하여 게이팅 매개변수를 설정합니다.
   1. AF555 단색 제어를 수행하려면 재현탁된 샘플 펠릿 20μL, 1x PBS(Ca²⁺, Mg²⁺ free) 970μL, 10% BSA(0.1% 최종) 10μL 및 NeuN-AF555 항체(1:1000 농도) 1μL를 추가합니다.
   2. APC 단색 제어를 수행하려면 재현탁된 시료 펠릿 20μL, 1X PBS(Ca²⁺, Mg²⁺ free) 970μL, 10% BSA(0.1% 최종) 10μL 및 PAX6-APC 항체(1:1000 농도) 1μL를 추가합니다.
   3. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 단독 제어를 수행하려면 재현탁된 샘플 펠릿 20μL, 1X PBS(Ca²⁺, Mg²⁺ free) 970μL 및 10% BSA(0.1% 최종) 10μL를 추가합니다(DAPI는 나중에 추가됨, 4.4 참조).
      메모: 두 개 이상의 항체를 사용하는 경우 단색 대조군 외에 FMO(Fluorescence-Minus-One) 대조군을 수행하는 것이 좋습니다.
3. 샘플과 대조군을 4°C에서 1시간 동안 어두운 곳에서 회전시켜 배양합니다.
4. 1:1000에 DAPI를 모든 샘플과 컨트롤에 추가하고 정렬을 진행합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pH 7.2 10배 PBS	인비트로젠	70013073
ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60	밀리포어	MAB377A5MI	형광 화합물 AF555에 접합된 마우스 anti-NeuN(여기, 553nm, 방출, 568nm)
ANTI-OLIG2 항체 클론 211	밀리포어	MABN50A4MI	형광 화합물 AF488에 접합된 마우스 anti-OLIG2(여기, 499nm, 방출, 520nm)
소 세럼 알부민	어부	BP9704-100
Bright-Line 카운팅 챔버	Hausser 사이언티픽	3110V
염화칼슘 무수	어부	C614-3
셀 스트레이너, 40 μM	SP 사이언스웨어	136800040
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)	인비트로젠	D1306 (영어
Dounce 티슈 그라인더	휘튼	357542
FACS 분류기	BD 바이오사이언스		BD FACS리아 III
마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트	어부	엠13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 테스트	노부스	NBP234705J
자당, 크리스탈 인증, ACS, 500 mg	어부	S5500
SW 41 Ti 스윙 버켓 로터	벡크만 쿨터	331362
Tris-HCl, 1M 용액, pH 8.0, 분자 생물학 등급, 초순수	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	J22638AE
트리톤X-100	어부	BP151-500	lysis buffer의 비이온성 계면활성제
트리판 블루 솔루션, 0.4%	지브코	15250061
초원심분리기	벡크만쿨터 옵티마 XE-100	A94516
초원심분리기 튜브 PP 9/16 X 3-1/2	벡크만 쿨터	331372
초순수 증류수(RNAse-, DNAse-free)	인비트로젠	10977023	증류수라고 합니다
초순수 EDTA	생명 기술	제15576-028