쥐 해마에서 다양한 신경 세포 집단 얻기

초록

출처: Schwarz, J. M. 쥐 뇌 조직에서 세포 유형 특이적 유전자 발현을 조사하기 위해 형광 활성화 세포 분류를 사용합니다. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 뉴런, 성상세포, 미세아교세포를 포함한 쥐 해마로부터 세포를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 수집

1. Buffer X에 베타-메르캅토에탄올을 최종 농도 0.067mM까지 첨가하여 Neural Dissociation Kit에서 Buffer X를 준비합니다(4개 샘플의 경우 13.5μl의 50mM 베타-메르캅토에탄올 10ml를 Buffer X 10ml에 첨가).
2. Neural Dissociation Kit의 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플에 대해 50μl의 효소 P와 1,900μl의 Buffer X를 혼합하여 Enzyme Mix 1을 준비합니다.예를 들어, 4개의 샘플에 대해 200μl의 효소 P와 7,600μl의 Buffer X를 혼합합니다.
3. 버퍼 X를 37ºC의 수조에 넣습니다.
4. 차가운 행크 완충염 용액(HBSS) 2ml(Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 제외)를 조직 해부를 위해 채취하여 얼음에 보관할 각 샘플에 대해 멸균 6웰 배양 플레이트의 한 웰에 넣습니다.

2. 신경 해리 (1 시간)

1. 6웰 배양 플레이트의 뚜껑에 있는 멸균 면도날을 사용하여 각 조직 샘플을 작은 조각으로 깍둑썰기합니다. 이 프로토콜은 약 30 - 100 mg의 조직 샘플에 사용되었지만, 최대 400 mg의 조직 샘플에 대해 승인되었습니다. 400mg보다 큰 조직 샘플의 경우 시약 부피를 적절하게 확장해야 합니다.
2. Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 신선한 HBSS 1ml를 사용하여 피펫으로 깍둑썰기한 조직 조각을 멸균 2ml 원심분리 튜브에 옮깁니다. 모든 샘플이 2ml 원심분리 튜브로 옮겨질 때까지 모든 샘플에 대해 2.1단계와 2.2단계를 반복합니다.
3. RT에서 2분 동안 300 x g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
4. 1,900 및 1.2 및 1.3 단계에서 준비한 대로 따뜻한 Enzyme Mix 1 을 각 샘플에 추가하고 튜브를 닫습니다.
5. 37ºC 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 조직 조각을 다시 현탁시킵니다.
6. 한편, 20μl의 Buffer Y와 10μl의 해동된 Enzyme A를 혼합하여 Enzyme Mix 2를 준비합니다(4개의 샘플에 대해 80μl의 Buffer Y와 40μl의 해동된 Enzyme A를 혼합).
7. 각 샘플에 30μl의 Enzyme Mix 2를 추가하고 부드럽게 뒤집습니다. 소용돌이치지 마십시오.
8. 파스퇴르 피펫 "1"로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 분쇄합니다.
9. 37ºC 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 조직 조각을 다시 현탁시킵니다.
10. 파스퇴르 피펫 "2"로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 반복하여 기포가 생성되지 않도록 합니다.
11. 파스퇴르 피펫 "3"으로 각 조직 샘플을 해리하고 위아래로 30회 반복하여 기포가 생성되지 않도록 합니다.
12. 37ºC 수조에서 10분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 침전된 세포를 다시 현탁시킵니다.
13. 15ml 팔콘 튜브 위에 놓인 80미크론 세포 균주에 단일 세포 현탁액을 적용하여 큰 파편을 제거하고 10ml의 HBSS(Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 포함)로 필터와 세포를 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 각 샘플이 깨끗한 15ml 매 튜브로 옮겨질 때까지 반복합니다.
14. RT에서 10분 동안 300 x g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.

3. 미엘린 고갈 (45 분)

1. 400 μl의 미엘린 제거 완충액으로 세포 펠릿을 철저히 다시 현탁시킵니다.
2. 지정된 양의 미엘린 제거 비드와 피펫을 위아래로 추가하여 완전히 섞습니다.
   메모: 사용되는 미엘린 제거 구슬의 양은 조직의 크기, 동물의 나이 및 특정 뇌 영역에서 예상되는 미엘린의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 성체 쥐 해마 샘플(약 300mg)의 경우 100μl의 수초체 제거 비드로 샘플을 배양합니다.
3. 4ºC의 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.
4. 각 샘플을 5ml의 미엘린 제거 버퍼로 세척합니다.
5. 300 x g에서 RT에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.
6. 샘플을 원심분리하는 동안 마그네틱 소터의 자기장에 각 샘플당 1개의 컬럼을 배치하고 각 컬럼 위에 깨끗한 80미크론 필터를 놓습니다.
7. 컬럼을 준비하고 각 컬럼을 1ml의 미엘린 제거 버퍼로 3회(총 3ml) 헹궈 필터링합니다. 모든 흐름은 빈 팁 상자 바닥과 같은 폐기물 용기에 수거합니다.
8. 검체 채취를 준비하기 위해 각 컬럼 바로 아래에 5ml의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브를 놓습니다.
9. 세포가 원심분리를 마치면 상층액을 흡인하고 500μl의 미엘린 제거 완충액에 완전히 재현탁합니다. 즉시 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고 아래 튜브에 세포를 수집합니다.
10. 필터와 컬럼을 1ml 미엘린 제거 버퍼로 4회(총 4ml) 세척합니다.
11. RT에서 10분 동안 300 x g의 세포 채취를 원심분리합니다.
12. 상층액을 흡인하면 이제 세포를 염색할 준비가 됩니다.

4. FACS를 위한 살아있는 세포 염색(염색 1시간)

1. 세포를 짧게 와류(2초)하여 펠릿을 분리하고 즉시 5μl의 Fc 블록(분화 32, CD32의 클러스터 방지)을 추가하고 다시 와류를 일으킨 다음 4ºC의 냉장고에서 5분 동안 배양합니다.
2. 한편, 세척 완충액 100μl당 0.125μl의 allophycocyanin(APC) 접합 CD11b 항체(1:800), 1μl의 anti-GLT1 항체(1:100) 및 0.4μl의 Fluorescein isothiocyanate(FITC) – conjugated Thy1 항체(1:250)를 추가하여 1차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플은 배양을 위해 100μl의 1차 항체 혼합물을 받습니다. 그러나 샘플이 400mg의 조직보다 훨씬 큰 경우 그에 따라 1차 항체 혼합물의 부피를 늘리는 것을 고려할 수 있습니다
3. 각 샘플 튜브에서 2μl의 세포만 제거하고 각 단일 염색 제어 튜브에 추가하여 단일 염색 대조군을 위한 튜브를 준비합니다. "단일 염색" 대조군에는 APC-CD11b 전용, GLT1 전용, FITC-Thy1 단독 및 PE 2차 항체 및 "공백" 또는 염색되지 않은 대조군이 포함됩니다.
   메모: 모든 샘플은 모든 염색 대조군에 표시되어야 하므로 각 샘플의 세포 2μl를 각 염색 대조 튜브에 추가해야 합니다.
4. 튜브를 간단히 와류(2초)하고 각 샘플 튜브에 100μl의 1차 항체 혼합물을 추가하고 각 염색 대조 튜브에 100μl의 적절한 1차 항체를 첨가한 다음 튜브를 다시 소용돌이치게 하고 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 형광 항체를 보호하고 4ºC의 냉장고에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 샘플은 샘플과 항체의 무결성을 유지하기 위해 나머지 절차 동안 서늘하게(4ºC에서) 유지해야 합니다.
5. 튜브를 간단히 소용돌이치고 각 튜브에 2ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
6. 350 x g에서 4ºC에서 5분 동안 원심분리기 튜브.
7. 한편, 세척 완충액 100μl당 PE 접합 토끼 2차 항체 0.2μl를 첨가하여 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플은 100μl의 2차 항체 혼합물을 얻습니다. 그러나 샘플이 400mg의 조직보다 훨씬 큰 경우 그에 따라 1차 항체 혼합물의 부피를 늘리는 것을 고려할 수 있습니다.
8. 원심분리가 완료되면 각 샘플의 상등액을 싱크대에 버리고 종이 타월로 튜브를 거꾸로 닦아냅니다.
9. 튜브를 간단히 와류로 가열하고 각 샘플 튜브에 100μl의 2차 항체 혼합물을 추가하고 각 염색 대조군에 적절한 2차 항체를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 다시 소용돌이치고 알루미늄 호일로 덮고 4ºC의 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.
   메모: GLT1 전용 염색 대조 튜브는 2차 항체 혼합물을 가져와야 합니다.
10. 배양 후 튜브를 잠시 와류로 돌리고 각 튜브에 2ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
11. 350 x g에서 4ºC에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
12. 원심분리가 완료되면 각 샘플의 상등액을 싱크대에 버리고 종이 타월로 튜브를 거꾸로 닦아냅니다.
13. 튜브를 소용돌이치고 각 튜브에 0.25ml의 멸균 PBS를 추가합니다. 샘플을 정렬할 준비가 되었습니다.
    메모: 더 많은 세포가 0.5ml의 멸균 PBS를 필요로 할 수 있습니다. 그러나 세포가 너무 농축되어 있으면 샘플이 항상 희석될 수 있으므로 더 낮은 부피로 시작하는 것이 가장 좋습니다.
    메모: 선택적으로 DNase를 튜브에 추가하여 세포가 응집되어 분류기가 막히는 것을 방지합니다. 또한 분류 직전에 멸균 80미크론 필터를 사용하여 샘플을 여과하여 분류기가 막히는 것을 방지할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
신경 해리 키트 (P)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-092-628
미엘린 제거 비즈 II	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-733
LS 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-401
QuadroMACS 분리기	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-976
MACS 멀티스탠드	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-303
나일론 메쉬 시트	아마존	CMN-0074-10야드	40인치 너비, 80미크론 크기 메쉬
Fc 블록 / 안티 CD32	BD 바이오사이언스	BDB550270	쥐에 대한 반응
APC-conjugated CD11b 항체	바이오레전드	201809	쥐에 대한 반응
토끼 안티 GLT1	Novus 생물학적 제제	NBP1-20136	쥐 또는 인간에 대한 반응성
PE 접합 항토끼 2차 항체	이바이오사이언스	1037259	anti-GLT1에 대한 2차 항체
FITC-conjugated anti-rat CD90 (Thy1) 마우스 항체	바이오레전드	202504	쥐에 대한 반응

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