1. 세포 분리를 위한 노화된 벌레의 준비 및 수집
- 웜을 수집하고 세포 분리를 위한 완충액을 준비합니다.
- 15mL 원뿔형 튜브에 벌레를 수집합니다. 1.5mL의 M9 완충액(1mM MgSO4, 85mM NaCl, 42mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7.0)을 플레이트에서 세척하고 1,600 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 1mL의 M9 버퍼로 지렁이를 세척합니다. 원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 대장균 오염을 최대한 제거합니다.
참고: 이 단계에서 암피실린과 같은 항생제(50μg/mL)를 추가하면 박테리아 오염을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 두 개의 샘플에 대해 2mL의 도데실황산나트륨-디티오트레이톨(SDS-DTT) 용해 완충액을 준비합니다: 200mM DTT, 0.25%(w/v) SDS, 20mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)(pH 8.0) 및 3%(w/v) 수크로오스.
- 15mL의 분리 완충액(118mM NaCl, 48mM KCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 25mM HEPES[pH 7.3])을 준비하고 ice.
에 보관합니다.
메모: SDS-DTT 용해 완충액과 분리 완충액은 모두 각 실험 전에 새로 만들어야 합니다.
- 큐티클 파괴 및 단일 세포 분리
- 1.1.1단계에서 1,600 x g에서 5분 동안 수집한 원심분리 동물. 1mL의 M9 배지에서 모든 상층액 및 현탁액 웜을 제거하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 1,600 x g에서 5분 동안 원심분리한 펠릿 웜.
- 200μL의 SDS-DTT 용해 완충액을 웜에 추가하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 광학 현미경으로 볼 때 몸을 따라 "윙클"하는 것처럼 보여야 합니다.
메모: SDS-DTT 용해 완충액에 장기간 노출되면 기생충이 사멸할 수 있으며, 이는 기생충을 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 죽은 벌레는 길어지고 말리지 않습니다.
- 800μL의 얼음처럼 차가운 분리 버퍼를 추가하고 튜브를 부드럽게 튕겨 혼합합니다.
- 4°C에서 13,000 x g에서 1분 동안 펠렛 웜을 투여하고 상층액을 제거한 후 1mL의 분리 버퍼로 세척합니다.
- 1.3.5단계를 총 5회 반복하면서 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
- 분리 완충액에 용해된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)(15mg/mL)(재료 표)의 프로테아제 혼합물 100μL를 펠릿에 추가하고 RT.
에서 10−15분 동안 배양합니다.
메모: SDS-DTT 용해 완충액과 마찬가지로, 확장된 단백질 분해 효소는 원형질막을 따라 단백질의 과도한 절단을 초래할 수 있으며, 이로 인해 마그네틱 비드를 통해 표면에 노출된 녹색 형광 단백질(GFP)의 분리를 방지할 수 있습니다.
- 프로테아제 혼합물로 배양하는 동안 200 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브의 바닥에 샘플을 위아래로 피펫팅하여 ~60−70회 기계적 파괴를 가합니다. 피펫 팁을 마이크로 원심분리 튜브의 벽에 대고 일정한 압력으로 세포를 적절하게 분리하십시오.
- 분해 단계를 결정하려면 소량의 분해 혼합물(~1-5 μL)을 제거하고 유리 슬라이드에 떨어뜨린 다음 조직 배양 현미경을 사용하여 검사합니다. 5-7분의 배양 후, 벌레 조각은 표피가 눈에 띄게 감소하고 세포의 슬러리가 쉽게 보일 것입니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신에서 최종 농도)이 보충된 900 μL의 시판되는 저온 Leibovitz의 L-15 배지로 반응을 중단합니다.
- 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 단편과 세포를 펠렛으로 분리합니다. 펠릿화된 세포를 1mL의 차가운 L-15 보충 배지로 두 번 더 세척하여 과도한 파편과 큐티클이 제거되었는지 확인합니다.
- 펠릿화된 세포를 L-15 보충 배지 1mL에 재현탁시키고 얼음 위에 30분 동안 방치합니다. 약 700−800 μL의 최상층을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 이 층은 세포 파편이 없는 세포를 포함하며 관심 세포의 후속 분리에 사용됩니다.
- 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 10-25 μL의 분리된 세포의 세포 밀도를 측정합니다.
2. 유세포 분석을 통한 GFP 양성 세포 분리
- 유세포 분석에 의한 GFP 양성 세포 분리
- 단계 1.2.12에서 수집한 분리된 세포 현탁액에서 4°C에서 10,000 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.상층액을 폐기하고 L-15가 보충된 배지에서 펠렛화된 세포를 6 x 106 cells/mL 이하의 세포 밀도로 현탁시켜 유세포 분석기의 과부하를 방지합니다.
- 시료를 분류할 수 있는 유세포분석기를 사용하여 GFP 양성 발현으로 세포를 분류합니다. GFP 음성 세포는 비세포 유형 특이적 분석을 위한 대조군으로 사용할 수 있습니다.
- 분리된 세포의 배양
- 분리된 세포를 멸균 6-well multi-well plate.
로 플레이트화합니다.
메모: 이 플레이트는 세포 부착력을 높이기 위해 땅콩 렉틴으로 코팅될 수 있습니다. 그러나 셀을 즉시 사용해야 하는 경우 이 단계를 무시할 수 있습니다.
- 플레이트를 플라스틱 용기에 넣고 젖은 물티슈 또는 부드러운 티슈 페이퍼(닦을 때 박테리아 성장이 없도록 이중 증류수[ddH2O]에 50μg/mL 암피실린 추가)로 세포를 배양하여 세포에 수분을 추가합니다. CO2 수치가 높아지면 세포가 손상될 수 있으므로 CO2 인큐베이터에서 배양하지 마십시오.
