Obtaining Cerebellum Slices from an Embryonic Chick Brain

초록

출처: Hanzel, M., et al. 병아리 소뇌 절편의 생체 외 배양 및 과립 세포 전구체의 공간적 표적 전기천공법. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 소뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다. 병아리 배아에서 소뇌를 분리하는 자세한 절차를 보여줍니다. 그런 다음 추가 실험 분석을 위해 조직 헬기를 사용하여 절개된 소뇌에서 조각을 준비합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 닭 배아 해부 14일차 (e14) 소뇌

1. 갈색 수정암의 알을 38°C에서 배아 14일까지 부화시킵니다.
2. 달걀 가위를 사용하여 난자에 있는 병아리 배아의 목을 자르고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 페트리 접시에 머리를 제거합니다(그림 1A).
3. 표준 집게를 사용하여 각 눈 뒤의 조직을 절개하여 눈과 위턱을 제거합니다. 인두를 완전히 절개하여 아래턱을 제거합니다(그림 1B).
4. 표준 집게를 사용하여 두개골 표면의 모든 피부를 벗겨내고(그림 1C) 전두골과 두정골을 제거하여 뇌를 드러냅니다.
5. 복부 측면에서는 인두 연골과 보조 중간엽을 제거합니다.
6. 등쪽 측면에서는 pia가 손상되지 않도록 주의하면서 뒷뇌로 향하는 중간엽 등쪽을 조심스럽게 제거하고 전체 뇌를 분리합니다(그림 1D).
7. 중뇌와 후뇌 사이의 조직을 완전히 절개하고 소뇌를 포함한 후뇌를 분리합니다(그림 1E).
8. 소뇌의 양쪽 측면 접합부와 뒷뇌의 연골판(alar plate)에 있는 조직을 완전히 절개하여 소뇌 전체를 제거하고, 해부 내내 pia의 무결성을 유지하도록 주의합니다(그림 1F). 또한 형성 맥락막신경총을 제거합니다(그림 1G).
9. 절개된 소뇌를 얼음처럼 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 옮깁니다.

2. e14 소뇌의 슬라이스 문화

1. 주걱을 사용하거나 구멍을 넓히기 위해 팁을 잘라낸 3ml 파스퇴르 피펫을 사용하여 소뇌 전체를 Tissue Chopper의 멸균 플랫폼으로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오.
2. 조직 초퍼 세트를 사용하여 최대 300%의 절단 속도로 소뇌 전체를 필요한 방향으로 50μm 두께로 절단합니다. 조직의 무결성은 시상 단면에서 가장 쉽게 보존됩니다. 그러나 방향은 세포 분석을 위한 중요한 고려 사항이기도 합니다(Purkinje 세포 수상돌기는 모양으로 정렬되어 있는 반면 과립 세포 축삭은 Purkinje 세포 수상돌기의 평면에 수직으로 가로로 움직입니다).
3. 3ml 파스퇴르 피펫을 사용하여 얇게 썬 소뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS로 덮습니다.
4. 끝이 잘린 3ml 파스퇴르 피펫을 사용하여 HBSS의 슬라이스를 60mm 페트리 접시에 담습니다.
5. 광섬유 광원으로 조명되는 해부 현미경 아래에서 워치메이커 집게를 사용하여 개별 슬라이스를 분리하십시오.
   메모: 배아에서 배양 배지의 절편 배양까지 각 해부는 경험에 따라 약 10-20분이 소요됩니다. 소뇌가 참수와 생체 외 배양 사이에 최소한의 시간을 할애하도록 한 번에 하나씩 해부를 수행합니다.

결과

그림 1. E14 병아리 배아에서 소뇌 해부. (A) 알에 있는 병아리의 목을 베고 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 페트리 접시에 머리를 제거합니다. 아래턱과 눈은 눈 뒤와 인두(점선)를 절개하여 제거합니다. (B) 두개골 표면의 피부를 제거합니다. (C) 전두골과 두정골을 제거하고 (D) 뇌를 둘러싼 중간엽과 연골에서 뇌를 제거합니다. (E) 해부 현미경으로 뇌의 뒤쪽 끝에 있는 소뇌의 위치를 확인합니다. 중뇌와 후뇌(점선) 사이를 잘라 소뇌와 복부 후뇌를 남깁니다. (F) 소뇌의 측면 접합부(꽃자루)를 절개하여 소뇌와 후뇌(점선)를 분리합니다. (G) 소뇌의 복부 쪽에서 맥락막신경총(별표)을 pia가 부착된 소뇌 전체가 온전하게 남을 때까지 제거합니다. 조직 다지기로 슬라이스를 준비하기 전에 소뇌를 얼음처럼 차가...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

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McIlwain 티슈 초퍼	Mickle 실험실 엔지니어링 회사		최상의 결과를 위해 300μm로 절단합니다.