Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

초록

출처: Malon, J. T., et al. 성체 마우스 척수 조직에서 1차 혼합 신경교 배양 준비. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 성체 쥐의 척수 조직에서 1차 혼합 신경교세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 이 프로토콜은 조직의 효소 분해를 포함하며, 그 후 단세포 집단을 얻기 위해 부서진 세포막과 미엘린 파편을 제거하는 것입니다. 그런 다음 세포는 혼합 신경교세포 성장에 최적화된 배지에서 배양됩니다.

프로토콜

1. 무균 조건에서 배양 후드의 용액 준비

1. 배양 배지 준비: DMEM(4.5g/L 포도당 포함), 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100IU/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신, 250ng/mL 암포테리신 B 및 50μM 2-메르캅토에탄올(2-ME, 1.1.1 참조)을 포함하는 Eagle's 배지(cDMEM)의 Dulbecco 변형을 완료합니다. 혼합 및 여과, 다른 모든 구성 요소를 멸균 한 다음 FBS를 추가합니다. 배양 배지를 4^°C에서 보관하십시오.
   1. 50mM 2-ME/인산염 완충 식염수(PBS) 원액 준비: 100μL의 농축된 2-ME(14.3M)를 28.6mL의 1x PBS에 첨가하고 필터 멸균합니다(용액은 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있음). 배양 배지 1,000mL당 2-ME 원액 1mL를 사용합니다.
2. 밀도 구배 매체의 준비
   1. 1파트 10x 일반 멸균 PBS와 9파트 멸균 스톡 밀도 그래디언트 배지(예: Percoll)에서 스톡 등장성 밀도 그래디언트 배지 용액(예: 100% Percoll)을 준비합니다.
   2. 100% 밀도 구배 배지(1.2.1에서 제조)를 일반 1x 멸균 PBS로 희석하여 20% 밀도 구배 배지(예: 40mL의 1x PBS가 있는 10mL의 100% 밀도 구배 배지)를 만들고 4°C에서 보관합니다. 세포 배양을 준비하기 전에 20% 밀도 구배 배지를 실온(RT)으로 가져옵니다.
3. 파파인 해리 시스템의 용액 준비
   참고: 파파인 해리 시스템은 재료 표에서 확인할 수 있습니다. 다른 유사한 해리 키트(사내에서 조립된 키트 포함)도 사용할 수 있습니다. 모든 구성 요소는 멸균 상태여야 합니다.
   1. 오보뮤코이드 억제제 혼합물(분말)에 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 32mL를 추가합니다.
   2. 파파인 바이알(분말) 1개에 EBSS 5mL를 첨가합니다. 파파인 바이알을 37^°C 수조에 10분 동안 또는 파파인이 녹을 때까지 놓습니다.
   3. 하나의 DNase 바이알(분말)에 500μL의 EBSS를 첨가합니다. 부드럽게 섞는다.
   4. DNase 용액 250μL(위)를 파파인 바이알에 추가합니다.
   5. 위의 파파인/DNase 혼합물의 총 필요량을 계산하고(마우스 척수당 약 800μL의 파파인/DNase 혼합물) 조직 소화를 위해 필요한 혼합물을 50mL 튜브로 옮깁니다. 남은 음식은 원래 바이알에 넣어 4°C에서 최소 2주 동안 보관하십시오.
   6. 필요할 때까지 키트의 모든 구성 요소를 얼음 위에 보관하십시오.
4. 척수 채취 튜브 준비: 5mL의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, 척수 채취용) 5mL가 들어 있는 멸균 15mL 튜브 1개와 PBS 1개(5mL 주사기 충전용)가 들어 있는 멸균 15mL 튜브 1개. 또한 HBSS 5mL가 든 멸균 페트리 접시(35mm 또는 60mm) 1개를 준비하여 배양 후드에 보관합니다.

2. 단세포 현탁액의 준비

참고: 모든 것을 살균 상태로 유지하기 위해 배양 후드에서 3단계와 4단계를 수행하십시오.

1. 모든 척수를 HBSS가 함유된 페트리 접시에 넣습니다. 각 척수를 멸균 가위와 집게로 가늘고 작은 조각으로 자릅니다. 멸균 겸자 또는 10mL 피펫을 사용하여 준비된 파파인/DNase 효소 혼합물이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브(단계 1.3.5)로 척수 조직을 옮깁니다(효소 혼합물에 HBSS를 첨가하면 준비된 효소 용액이 더 희석되고 효소의 성능이 저하될 수 있으므로 피하십시오).
2. 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 섞습니다. 150rpm에서 궤도 쉐이킹으로 인큐베이터/셰이커에서 37^°C에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다.
3. 튜브를 다시 소용돌이치고 5mL 피펫을 사용하여 조직과 함께 효소 용액을 격렬하게 분쇄하여 추가 해리를 촉진합니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 RT에서 5분 동안 300 x g로 원심분리합니다.
5. 원심분리 중에 멸균 튜브에서 2.7mL EBSS와 300μL의 재구성된 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(1.3.1)을 혼합합니다. DNase 용액 150μL를 추가합니다(단계 1.3.3).
6. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 위에서 제조된 용액으로 세포 펠렛을 재현탁합니다(단계 1.5). 세포 펠릿을 깨뜨리기 위하여 우물을 소용돌이치십시오.
7. 세포 현탁액에 3mL의 재구성된 알부민-오보뮤코이드 억제제 용액(단계 1.4.1)을 추가합니다. RT에서 6분 동안 70 x g의 원심분리 세포를 제거합니다.상층액(멤브레인 절편 포함)을 제거합니다.

3. Single Cell Suspension에서 Myelin의 추가 제거

1. 20% 밀도 구배 배지 8mL(단계 1.2.2에서 준비)를 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 추가하고, 펠릿을 부드럽게 소용돌이치게 하고, 제동 없이 RT에서 30분 동안 800 x g에서 세포를 원심분리합니다. 파편(주로 미엘린)의 최상층과 상층액을 조심스럽게 제거하되 펠릿은 보관하십시오.
2. 밀도 구배의 잔여물을 제거하려면 세포 펠릿을 8mL의 희석된 cDMEM(cDMEM 1부 및 HBSS 2부)으로 재현탁하여 세포를 세척합니다. 400 x g에서 4 ^oC에서 10분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고 동일한 방법으로 희석된 cDMEM(위)으로 세포를 다시 세척합니다. 세포를 파종할 때까지 얼음 위에 세포를 보관하십시오.
3. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 배양 배지(2-ME와 함께 제공되는 cDMEM(단계 1.1에서 준비))에 재현탁합니다. 12웰 플레이트 1개에는 3 mL x 4(사용된 마우스 수) + 2 mL = 14 mL 배지를 사용합니다. 이렇게 하면 전체 플레이트(12웰)에 충분한 세포 현탁액이 보장되고 웰당 평균 세포 수와 배양물의 미세아교세포 함량을 결정하는 데 사용할 수 있는 추가 웰이 제공됩니다. 다른 유형의 배양 용기를 사용할 경우 필요한 배양 배지의 총 부피를 비례적으로 계산하십시오.
4. 1mL의 세포 현탁액을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
5. 35.9 ^oC에서 5 % CO₂로 세포를 배양합니다.
6. D 1에서 미디어를 교체(흡인을 통해 이전 미디어 제거)한 다음 그 후 3 - 4d마다(일반적으로 D: 1, 4, 8 및 11에서 미디어를 변경한 다음 12일차에 셀 사용).
   메모: 1일차에, 배양액은 척수 조직의 잔류 수초로 인해 상당한 양의 파편을 포함할 수 있습니다. 따라서 1일차에 미디어를 교체하는 것이 좋습니다. 배양은 D 12 - 14 사이에 치료할 준비가 되었습니다. 세포는 일반적으로 D 12에서 80% 합류하며 D 14에서 100% 융합에 가까워질 수 있습니다. 전형적으로, D 12에서는 12-웰 플레이트에 웰 당 약 100,000개의 세포가 존재한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 4.5g/L 포도당을 함유한 Eagle's media(DMEM) 변형	론자	12-709층	cDMEM 배지는 널리 사용되는 표준 배양 배지입니다. 개별 연구자는 DMEM 및 cDMEM 배지를 만드는 데 사용되는 기타 모든 구성 요소를 어디에서 구입할지 결정할 수 있습니다.
L-글루타민(100x)	론자	17-605E	L-글루타민은 다양한 배양 배지에 널리 사용되는 표준 구성 요소입니다. L-글루타민은 개별 연구자가 어디서 구입할지 결정할 수 있습니다.
항생제-항진균 용액(100개)	코닝-미디어텍	제30-004-CI	이것은 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신의 조합으로 10,000 units/mL 페니실린 G, 10 mg/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 25 μg/mL 암포테리신 B를 함유하도록 제조되었습니다. 개별 연구자는 개별 성분을 어디에서 구입할지 결정할 수 있습니다.
2-메르캅토에탄올(2-ME)	시그마-알드리치	M3148	세포 배양, 분자 생물학 및 전기 영동에 적합한 BioReagent입니다.
파파인 해리 시스템	워딩턴 생화학 공사	LK003150	이 키트의 개별 구성 요소는 별도로 구입할 수 있습니다.
퍼콜	GE 헬스케어	Tel.: 17-0891-01	Percoll은 멸균 용액으로 판매됩니다. 묽게 하지 않은 Percoll은 필요한 경우 다시 고압멸균할 수 있습니다.
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