방법 논문

이(Otic progenitor) 세포를 감각 상피 세포(sensory epithelial cell)로 분화한 후 면역염색(immunostaining)

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Azadeh, J. et al., Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells(불멸의 다능성 귀 전구 세포에서 분화 시작).J. Vis. 특급 (2016).

이 동영상은 불멸화된 다능 이암 전구세포(iMOP) 세포가 감각 상피 세포로 분화되는 과정을 보여줍니다. iMOP 세포 배양, 이구 형성, 분화 유도, 형광 현미경을 통해 세포 구성 요소 및 분화 마커를 시각화하여 성공적인 세포 분화를 확인하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

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1. IMOP 셀에서 자가 재생 유지

  1. iMOP 배양 배지 준비: DMEM/F12, 1X B27 보충제, 25μg/ml 카르베니실린 및 20ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF). 멸균 시약을 사용하여 50ml의 iMOP 배양 배지를 만듭니다. 37°C 수조에서 50ml 원뿔형 수조에 49ml의 DMEM/F12를 예열합니다.
    1. 50X B27 보충제와 필터 멸균 처리된 100mg/ml 카르베니실린 분취액을 37°C 수조에서 5분 동안 해동합니다. RT에서 100μg/ml bFGF 부분 표본을 해동합니다.1ml 50X B27, 10μl의 100μg/ml bFGF 및 12.5μl의 100mg/ml 카베니실린을 DMEM/F12에 추가합니다.
  2. iMOP 세포 배양을 위해 60mm 조직 배양 접시에 3ml의 배지를 사용합니다. 미디어 양을 두 배로 늘려 격일로 문화에 새로운 미디어를 추가합니다. bFGF의 농도가 5ng/ml 이하로 떨어지지 않는지 확인합니다.
    1. 37°C에서 5% CO로 iMOP 세포 배양2. 아래 단계에 나열된 대로 5-7일 후 배양에서 세포를 배양합니다. 10ml 피펫 팁을 사용하여 배양물을 15ml 원뿔형으로 옮깁니다.
  3. 0.1ml의 0.5M EDTA pH 8.0을 HBSS 50ml에 희석하여 HBSS에서 1mM EDTA를 만듭니다. 37°C 수조에서 HBSS로 만든 1mM EDTA를 예열합니다.
  4. RT에서 5분 동안 200 x g에서 중력 침강 또는 원심분리로 세포를 수확합니다. 중력 침전을 위해 배양액이 들어있는 15ml 원뿔형을 37 ° C 인큐베이터에 5-10 분 동안 놓습니다. 그 후, 15ml 원뿔형.
    의 바닥에 이구가 모이는 것을 관찰하십시오. 메모: 과도한 원심력은 세포 손상을 유발할 수 있습니다.
  5. 세포 펠릿을 방해하지 않고 2ml 흡인 피펫을 사용하여 사용한 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 세포 펠릿에 예열된 0.5mM EDTA HBSS 용액 1ml를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 위아래로 2 - 3회 부드럽게 피펫을 두드립니다. 37°C에 원뿔형을 놓고 <5분 동안 배양하여 단일 세포로의 해리를 용이하게 합니다.
  6. 세포 용액을 부드럽게 소용돌이쳐 이구가 해리되었는지 확인합니다. 원뿔의 바닥으로 침전되는 이구가 없으면 세포가 해리됩니다. 배양 시간은 다를 수 있습니다.
    메모: EDTA로 장기간 배양하면 과도한 세포 사멸을 초래할 수 있습니다.
  7. 37 ° C에서 세포를 제거하고 2ml의 배지를 첨가하여 EDTA를 중화하고 희석합니다. RT에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리하여 세포를 수집합니다. 2ml 흡입 피펫을 사용하여 희석된 EDTA를 흡입하고 1X PBS 5ml를 추가하여 세포를 세척합니다.
  8. RT에서 5분 동안 200 x g에서 세포를 스핀다운하고 2ml 흡입 파이펫을 사용하여 1X PBS를 흡입합니다. 0.5ml의 iMOP 배양 배지에 P1000 피펫을 사용하여 위아래로 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
  9. 적절한 카세트와 함께 미세유체 입자 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. iMOP 셀의 합류 플레이트에는 ~6 X106 셀이 포함됩니다. 배지에서 세포를 1:100으로 희석하고 카세트에 75μl의 세포 용액을 추가하여 계수합니다. 1 x 106 세포를 6cm 접시에 담아 iMOP 배양 배지에 플레이트화합니다(~1:10 희석). 5 - 7일마다 iMOP를 받으세요.
    메모: 큰 이구를 형성하거나 조직 배양 접시의 바닥에 부착되는 세포는 분화합니다. 배양물이 과도하게 융합되면 세포도 죽습니다.

2. IMOP 세포를 감각 상피로 분화

  1. iMOP 감각 상피 분화 배지 50ml를 준비합니다: DMEM/F12, 1X B27 보충제, 25μg/ml 카르베니실린. iMOP 감각 상피 분화 배지 50ml를 만듭니다. 37°C 수조에서 50ml 원뿔형 수조에 49ml의 DMEM/F12를 예열합니다. 50X B27 보충제와 100mg/ml 카르베니실린 분취액을 37°C 수조에서 5분 동안 해동합니다. DMEM/F12에 1ml 50X B27 및 12.5μl의 100mg/ml 카르베니실린을 추가합니다.
  2. 세포를 수확, 해리, 재현탁 및 계수하려면 1.4-1.9단계를 반복합니다
    3. .
  3. 1 x 106 세포를 6cm 접시에 담아 3일차에 iMOP 배양 배지를 사용하여 플레이트합니다. 0일차에 10ml 피펫을 사용하여 배양물을 15ml 원뿔형으로 옮깁니다. 1.6단계에서 설명한 대로 중력 침전에 의해 이구를 수집합니다. 2ml 흡인 피펫을 사용하여 사용한 배지를 흡입하고 이구를 원뿔 바닥에 남겨 둡니다.
  4. 감각 상피 분화 배지 2ml를 부드럽게 첨가합니다. 큰 구멍 6ml 피펫을 사용하여 10cm 접시에 이구를 옮깁니다.
    메모: 거친 피펫팅으로 인한 기계적 전단은 이구에서 세포를 해리할 수 있습니다.
  5. 격일로 2ml의 새로운 감각 상피 분화 배지를 배양액에 첨가하십시오. 필요한 경우, 세포는 중력 침전 및 대체 매체에 의해 수집될 수 있습니다.
  6. 10일차에 15ml 원뿔형으로 옮기고 1.6단계에서 설명한 대로 이구가 침전되도록 하여 이구를 수집합니다. 2ml 흡인 피펫을 사용하여 사용한 배지를 흡인하고 이구를 방해하지 않도록 합니다.
  7. RT에서 15분 동안 1X PBS에 4% 포름알데히드를 주입하여 이구를 고정합니다. 포름알데히드 용액을 제거하고 세척 버퍼(0.1% TritonX-100을 함유한 1X PBS)로 이구를 세척한 후 차단 버퍼(10% 일반 염소 혈청 10% 및 0.1% Triton X-100을 함유한 1X PBS)에서 1시간 동안 배양합니다.
    1. buffer를 교체하고 차단 buffer의 샘플을 희석된 항체로 배양합니다. 4 °C에서 배양합니다.0.1% Triton X-100이 함유된 1X PBS로 샘플을 세척하고 이구에 면역 염색을 적용합니다. 이구를 1X PBS로 옮기고 P1000 피펫을 사용하여 이구를 유리 슬라이드의 장착 매체에 놓습니다. 샘플 위에 커버슬립을 놓고 장착 매체를 4°C에서 건조시킵니다.
  8. 16비트 CCD 카메라와 20X 0.75 공기 또는 40X 1.3 NA 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 도립 현미경 설정을 사용하여 에피 형광 이미지를 획득합니다. 청색(377 ± 25nm/447 ± 30nm), 녹색(475 ± 25nm/540 ± 25nm), 적색(562 ± 20nm/ 및 625 ± 20nm) 및 적외선(628 ± 20nm/ 및 692 ± 20nm)과 같은 나열된 파장을 사용하여 다양한 색상 채널에서 형광을 수집합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 두께 유리 커버 슬립 (원형 12mm)전자 현미경 과학72230-01
DMEM/F12생명 기술제11320-082
인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4생명 기술제10010-023
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)생명 기술제14025-092
B27 보충제 (50X) 무세럼생명 기술제17504-0441ml의 부분 표본으로 보관
Prolong Gold Antifade Mountant생명 기술47743-73610 mg/ml 100 μl 분취량으로 보관
Moxi Z Mini 자동 세포 계수기오르플로 MXZ001
Moxi Z 카세트 타입 S오르플로 MXC002
재조합 쥐 섬유아세포 성장인자, 염기성(bFGF)페프로텍450-33H20 중 0.1% BSA에 재현탁하고 20mg/ml 분취액으로 보관
카르베니실린, 디소듐 소금써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificBP2648-110mM Hepes pH 7.4에 재현탁하고 100mg/ml 분취액으로 보관
5ml 피펫 개별 포장 페이퍼백(200개/케이스)써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific1367811D
10ml 피펫 개별 포장 페이퍼백(200개/케이스)써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific1367811E를 참조하십시오.
조직 배양 처리 6cm 접시써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific130181
TipOne 필터 피펫 팁 0.1-10 ul 길쭉한 필터 팁미국 과학전화: 1120-3810
팁One 필터 피펫 팁 1-20 ul 필터 팁미국 과학1120-1810
팁One 필터 피펫 팁 1-200 ul 필터 팁미국 과학제1120-8810
TipOne 필터 피펫 팁 101-1000 ul 필터 팁미국 과학제1126-7810
15ml 원뿔형 튜브, 멸균 25개 튜브(500개 튜브)로 구성된 20봉지미국 과학제1475-0511
50ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브(500개 튜브)로 구성된 20봉지미국 과학1500-1211
년 호 호 호 호 시리즈 년 ) ) ) ) 년 호 호 호 년

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

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태그

12DNA

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