불멸화된 다능성 귀 전구세포를 나선형 신경절 뉴런으로 분화시키고 분화 평가

이 논문에서

초록

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출처: Azadeh, J., et al. 불멸의 다능성 귀 전구 세포에서 분화 시작. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 불멸화된 다능 이염 전구세포(iMOP)가 나선형 신경절 뉴런(SGN)으로 분화되고 면역형광 기반 분화를 확인하는 방법을 보여줍니다. iMOP는 SGN으로 분화하기 위해 신경 분화 배지에서 배양 기질로 코팅된 커버슬립에 도금됩니다. 분화된 세포는 신경 분화 마커에 특이적인 항체로 표지되고 현미경으로 분석되어 분화를 확인합니다.

프로토콜

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1. iMOP 유래 뉴런 분화

50ml의 신경 분화 배지 만들기: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-Glutamine. 50X B27 및 200mM L-글루타민 병을 37°C 수조에서 5분 동안 해동합니다. 1ml 50X B27 및 0.5ml 200mM L-글루타민을 48.5ml의 Neurobasal 배지에 첨가합니다.
멸균된 12cm 플레이트에 1.5mm 원형 10 유리 커버슬립을 놓고 커버글라스를 코팅하고 플레이트에 70% 에탄올(EtOH)을 첨가하여 커버슬립을 살균하고 청소합니다.
커버슬립이 에탄올로 덮여 있는지 확인하기 위해 부드럽게 저어줍니다. RT에서 플레이트를 10분 동안 그대로 둡니다. 남은 에탄올을 씻어내기 위해 멸균 3X 인산염 완충 식염수(PBS)로 커버슬립을 1회 헹굽니다. 덮개 슬립을 멸균 H₂O로 한 번 헹구어 나머지 1X PBS를 씻어냅니다.
2ml 흡인 피펫을 사용하여 H₂O를 흡인하고 커버슬립을 건조시킵니다. 커버슬립을 조직 배양 후드의 자외선에 15분 동안 노출시킵니다. 커버슬립은 즉시 사용하지 않을 경우 멸균 환경에 보관하십시오.
12웰 접시의 각 웰에 24mm 원형 커버슬립 1개를 놓습니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 커버 슬립이 우물 바닥에 평평하게 놓이도록 합니다.
실온(RT)에서 2mg/ml 폴리-D-라이신 원액을 해동하고 1X PBS에서 10μg/ml 폴리-D-라이신 농도로 희석합니다. 웰에 10ug/ml 폴리-D-라이신 0.25ml를 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 그대로 두십시오.
멸균 3X PBS로 웰을 1회 세척합니다. RT에서 10mg/ml 라미닌 원액을 해동하고 1X PBS에서 10μg/ml로 희석합니다. 0.25ml의 10μg/ml 라미닌 작업 용액을 24개의 다중 웰 접시의 단일 웰에 추가합니다. 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 2ml 흡입 피펫을 사용하여 라미닌 용액을 흡입합니다.
P1000 피펫으로 1X PBS 1ml를 넣고 2ml 흡인 피펫으로 흡인하여 1X PBS를 제거하여 1X PBS로 커버슬립을 3회 세척합니다. 세포를 플레이트링할 준비가 될 때까지 웰에서 마지막으로 세척한 후 1X PBS를 그대로 둡니다. 세포를 채취하고, 해리하고, 계수하여 신경 세포 분화를 시작합니다. 1 x 10⁶ 셀을 6cm 접시에 담아 -3일차에 플레이트합니다.
Day 0에서 세포를 수확, 해리 및 계수합니다. 1 x 10⁵- 1.5 x 10⁵ iMOP 세포를 24개의 멀티웰 접시에 웰당 0.5ml의 예열된 뉴런 분화 배지에 파딩합니다. 격일로 사전 예열된 신경 세포 분화 배지를 흡인하고 배양에 추가합니다.
4% 포름알데히드의 iMOP 유래 뉴런을 7일째 RT에서 15분 동안 고정합니다. 포름알데히드 용액을 제거하고 iMOP 유래 뉴런을 세척 완충액(0.1% TritonX-100 함유 1X PBS)으로 세척한 후 차단 완충액(10% 일반 염소 혈청 10% 및 0.1% Triton X-100 함유 PBS 1X)에서 1시간 동안 배양합니다.
1. buffer를 교체하고 차단 buffer의 샘플을 희석된 항체로 배양합니다. 4°C에서 배양합니다.0.1% Triton X-100 대상 세포를 면역염색 대상으로 하는 1X PBS로 샘플을 세척합니다. 장착 매체에 장착하기 전에 1X PBS로 커버 유리를 세척하십시오. 에피 형광 이미지를 획득하기 전에 장착 매체를 4°C에서 건조시킵니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름

회사

카탈로그 번호

1.5 두께 유리 커버 슬립 (원형 12mm)

전자 현미경 과학 7

72230-01

DMEM/F12

생명 기술

제11320-082

Neurobasal 배지

생명 기술

21103

인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4

생명 기술

제10010-023

B27 보충제 (50X) 무세럼

생명 기술

제17504-044

1ml의 부분 표본으로 보관

L-글루타민(200mM)

생명 기술

제25030-081

5ml 분취량으로 보관

천연 마우스 라미닌

생명 기술

23017-015

1 mg/ml 분취량으로 보관

Prolong Gold Antifade Mountant

생명 기술

47743-736

10 mg/ml 100 μl 분취량으로 보관

Moxi Z Mini 자동 세포 계수기

오르플로

MXZ001

Moxi Z 카세트 타입 S

오르플로

MXC002

폴리-D-라이신

시그마

P7886

1X PBS에 재현탁하고 10 mg/ml 100 μl 분취액으로 보관

5ml 피펫 개별 포장 페이퍼백(200개/케이스)