동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 기기, 솔루션 및 매체 준비
참고: 프로토콜에 보고된 재료, 시약, 도구 및 기기에 대한 모든 정보는 재료 표에 명시되어 있습니다.
- 모든 박리 기구를 고압멸균하여 멸균 구역에 보관하십시오. 다음 도구를 사용하십시오 : 표준 집게 4 개 (긴 집게 2 개, 짧은 집게 2 개)와 가위 2 개, 집게 2 개 (긴 집게 1 개, 짧은 집게 1 개) 및 해부 용 가위 1 개; 여분의 세트를 백업으로 보관하십시오.
- 세척, 면역 라벨링 절차 및 세포 분류 단계에서 사용할 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)/1% 소 태아 혈청(FBS) 용액 100mL를 준비합니다. 용액을 4°C에서 냉각
유지하십시오.
메모: 아지드화나트륨(NaN3)은 살아있는 세포에 독성이 있을 수 있으므로 용액에 첨가하지 마십시오.
- PBS 99mL 및 FBS 1mL를 사용하여 PBS 100mL/1% FBS를 준비합니다.
- 수집 및 배양 배지로 사용하기 위해 3% FBS(재료 표 참조)가 보충된 100mL의 멸균 신경 세포 배지를 준비합니다. 세포 배양 배지를 4°C에서 멸균 상태로 유지하십시오. 사용하기 전에 실온(RT)으로만 데우십시오.
- 97mL의 신경 세포 배지와 3mL의 FBS를 사용하여 3% FBS가 보충된 100mL의 신경 세포 배지를 준비합니다.
- 얼음 양동이에 넣어 5mL의 수집 배지로 사전 코팅된 사전 냉각 수집 튜브(5mL 튜브). 세포가 튜브 표면에 부착되는 것을 방지하기 위해 폴리프로필렌 튜브만 사용하십시오.
- 40mm 접시, 70μm 나일론 여과기, 주사기, 세포 여과기용 절굿공이, 멸균 폴리프로필렌 튜브를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 시술 전에 모든 품목을 멸균하고 시술 전반에 걸쳐 멸균 방식으로 유지하십시오.
메모: 망막 채취 후의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
2. 망막 세포 현탁액의 준비
- 수집된 안구를 해부 현미경의 바닥판에 올려 놓고 각막 박리를 시작합니다. 각 눈을 개별적으로 절개합니다.
- 집게를 사용하여 시신경 기저부에서 지구본을 조심스럽게 잡습니다. 이 단계에서는 긴 표준 겸자 하나와 짧은 겸자 하나를 사용합니다.
- 30게이지(30G)의 날카로운 바늘을 사용하여 각막에 구멍을 뚫습니다. 이렇게 하면 수액이 눈에서 빠져나갈 수 있어 집게로 눈을 잡기가 더 쉬워집니다.
- 집게로 각막을 잡고 가위를 사용하여 각막을 작게 절개합니다. 집게를 사용하여 각막과 공막을 부드럽게 벗겨냅니다. 지구본이 반쯤 벗겨지면 집게를 사용하여 망막과 렌즈를 굴립니다. 각막, 공막, 수정체는 버리십시오.
메모: 이 방법은 망막이 눈의 나머지 부분에서 완전히 분리되도록 합니다.
- PBS/40% FBS.
가 들어 있는 작은 1mm 페트리 접시에 망막을 놓습니다.
메모: 페트리 접시의 대안으로, 세포 배양 접시를 사용할 수 있습니다. 생리학적 조건에서와 같이 망막을 항상 촉촉하게 유지하십시오.
- 생물 안전성 캐비닛 내에서 신선한 멸균 PBS/1% FBS로 각 망막을 세 번 세척합니다.
- PBS/1% FBS를 적신 멸균 70μm 나일론 여과기에 최대 12개의 망막을 배치합니다. 10mL 주사기의 뒤쪽 끝을 사용하여 세포를 분리하기 위해 원을 그리며 망막을 부드럽게 침식합니다.
- 또는 세포 스트레이너 침용을 위해 유봉을 사용하거나 37°C에서 15분 동안 15IU/mL 파파인, 5mM L-시스테인 및 200U/mL DNase I을 조합한 효소 분해를 사용한 다음 PBS/10% FBS로 불활성화합니다.
메모: 회수된 세포의 비율에는 효소 분해를 주사기 뒤쪽 끝 또는 유봉을 사용한 침용과 비교할 때 관찰되지 않았습니다.
- 분리된 세포를 옮기려면 멸균 70μm 나일론 스트레이너를 폴리프로필렌 수집 튜브 위에 놓습니다. 수집된 세포를 P1000 피펫을 사용하여 스트레이너에 통과시킵니다. 스트레이너(3.6단계)를 PBS/1% FBS로 헹구어 잔여 세포를 분리하고 수집 튜브로 옮깁니다.
- PBS/1% FBS를 추가하여 망막당 1mL의 최종 부피를 얻습니다. 200 x g 및 RT.
에서 7분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
참고: 침식된 망막(< 6 retinae)의 수에 따라 세포 펠릿이 너무 작아서 보이지 않을 수 있습니다.
- 세포 상등액을 버리고 세포 펠릿을 망막 5개당 1mL의 비율로 PBS/1% FBS에 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
- 유리 혈구계를 세척하고 70% 알코올로 커버슬립을 합니다. 세포가 들어 있는 튜브를 부드럽게 휘젓아 망막 세포 현탁액이 고르게 분포되도록 합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 0.4% 트리판 블루 20μL를 넣고 세포 현탁액 20μL와 혼합합니다.
- 부드럽게 혼합하고 0.4% 트리판 블루/세포 현탁액 혼합물 10μL를 혈구계에 바르고 양쪽 챔버를 채웁니다. 모세관 작용으로 0.4% 트리판 블루/세포 현탁액 혼합물을 커버슬립 아래로 끌어당깁니다. 현미경을 사용하여 모든 트리판 블루 음성 세포를 계수합니다. 이 숫자는 살아있는 셀을 나타냅니다.
- 다음 공식을 사용하여 세포 생존율을 계산합니다: Live cell count / total cell count = % viability.
메모: 세포의 생존율이 95% 미만인 경우, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중 세포 생존율을 구별하기 위해 형광 염료가 필요합니다.
- 살아있는 세포에 투과되지 않는 형광 생존도 염료를 사용하십시오. PBS로 세포를 씻어 혈청의 흔적을 제거합니다. 100μL 최종 부피에서 5.0 x 106 세포당 세포 생존율 구별을 위해 1μL의 형광 염료를 추가합니다. 빛으로부터 보호받으며 15분 동안 RT에서 배양합니다. PBS 볼륨의 10배/1% FBS를 추가합니다. 200 x g 및 실온에서 5분간 원심분리기.
- 필요한 경우 세포 현탁액을 4°C에서 밤새 배양합니다. 이 경우 세포 현탁관을 PBS/1% FBS가 아닌 신경 세포 배지로 채웁니다. 튜브를 수평으로 놓고 4°C로 유지합니다.
3. 망막 세포의 면역 표지
- 다음 변환을 사용하여 세포 수당 항체 부피를 확인합니다: 100μL 부피에서 5.0 x 106 세포당 2μL의 항체.
- 세포를 세척하고 PBS/1% FBS로 유지하십시오. 정렬 설정 시 음성 대조군(레이블이 지정되지 않음)으로 사용할 작은 세포 분취량(5.0 x 10, 6개 세포)을 취합니다.
메모: 이 negative control은 cell sorter의 적절한 보정에 매우 중요합니다.
- Fcγ 수용체 II 및 III를 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 PBS/1% FBS를 사용하여 50μL 최종 부피에 1.0 x 106 세포당 1μL의 항마우스 CD16/32 항체를 추가합니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 샘플에 항체 칵테일을 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 얼음 양동이에서 30분 동안 배양합니다. 빛이 태그가 지정된 형광단의 광표백으로 인해 실험을 손상시킬 수 있으므로 얼음 양동이가 덮여 있는지 확인하십시오.
- CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (Phycoerythrin)-Cyanine7, CD15 PE 및 태그가 지정되지 않은 CD57.
형광 태그가 지정된 안티 마우스 항체를 사용하여 항체 칵테일을 준비합니다.
참고: 각 항체에 대해 5.0 x 106 세포당 다음 농도를 사용하십시오: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE- 시아닌 7, 0.4 μg; CD15 PE, 0.02 μg; 및 태그가 지정되지 않은 CD57, 0.4 μg.
- 다음 계산에 따라 부피를 사용하십시오 (재료 표에 나열된 상업적으로 이용 가능한 항체를 기준) : 총 5.0 x 107 셀 라벨링; 5.0 x 106 세포 당 2 μL = 각 항체의 20 μL; 4 개의 다른 항체 = 80 μL의 항체 칵테일; 최종 부피 = [(5.0 x 107 총 세포) / 5.0 x 106 세포] x 100 = 1,000 μL; 80μL Abs + 50μL 안티 마우스 CD16/32 + 870μL PBS/1% FBS = 1,000μL.
메모: 이 조합은 기기 구성을 위한 최적의 형광 색소 조합을 제공했습니다. 다음 매개변수는 방출 및 여기를 요약합니다: AF-700, 638nm 적색 다이오드 레이저로 여기할 때 719nm 방출; PE-Cyanine7, 488nm 청색 다이오드 레이저로 여기할 때 767nm 방출; 및 PE, 488nm 청색 다이오드 레이저로 여기할 때 575nm 방출.
- 30분 배양 후 PBS/1% FBS를 사용하여 최대 5mL의 용량을 가져옵니다. 200 x g 및 RT에서 7분 동안 원심분리하여 샘플을 세척합니다. 절차를 한 번 반복하여 결합되지 않은 모든 항체를 제거합니다.
- 2 μL의 2 차 항체 (0.1 μg)를 추가하면 5.0 x 106 세포의 CD57에 결합합니다. 3.4단계와 같이 얼음 양동이에서 30분 동안 배양합니다. 3.5단계와 같이 셀을 두 번 씻습니다.
- 3.4.
단계에서 태그가 지정되지 않은 1차 항체가 사용된 경우 2차 항체로 세포를 라벨링합니다.
참고: 이 구성에 대해 선택되는 2차 항체는 Table of Materials에 나열되어 있습니다. 방출 파장은 421nm입니다. 405 nm에서 바이올렛 다이오드 레이저로 여기할 때 450/50 nm의 대역 통과 필터와 함께 사용하십시오.
- 다음 계산에 따라 부피를 사용하십시오(재료 표에 나열된 시판되는 항체 기준): 5.0 x 106 세포 당 2 μL = 20 μL의 2차 항체; 최종 부피 = [(5.0 x 107 총 세포)/5.0 x 106 세포] x 50 = 500 μL; 20 μL Abs + 480 μL PBS/1% FBS = 500 μL.
- 라벨링된 셀을 PBS/1% FBS로 유지합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 최종 망막 세포 농도 3.0 - 4.0 x 107 cells.
사용
메모: 페놀 레드는 자가형광을 증가시켜 음성 세포와 양성 세포 사이의 해상도를 감소시킬 수 있으므로 세포 배양 배지를 사용하여 세포를 희석하지 마십시오. 부피당 최종 세포 농도는 기기 구성의 부피 유량에 따라 크게 달라집니다.
- 설정하는 동안 단색 컨트롤을 사용하여 형광 유출을 최소화합니다.
메모: 보상(compensation)이라고도 하는 이 단계는 형광단의 조합으로 인해 생성되는 노이즈를 보정하기 위해 적용됩니다. 여러 종의 형광 표지된 면역글로불린(Ig) 이소형과 결합할 수 있는 용량이 있는 PBS/0.1% BSA/2mM NaN3의 폴리스티렌 미세구는 보상을 설정하기 위한 양성 대조군을 제공합니다.
- 폴리스티렌 미세구 3방울을 멸균 FACS 튜브에 넣고 형광단당 1방울을 할당합니다. 각 튜브에 해당 형광단 1μg을 추가합니다. RT에서 15분 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다. 샘플 튜브에 PBS/1% FBS 3mL를 추가합니다. 200 x g 및 RT에서 5분 동안 원심분리기를 가열합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 250μL의 PBS/1% FBS에 재현탁합니다.
- 음성 대조군을 설정하려면 Ig에 결합하지 않는 폴리스티렌 미세구를 사용하십시오. 필요한 경우 전날 이 단계를 수행합니다.