Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Brain Microvascular Endothelial Cells

초록

출처: Pong, S. et al., 인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세혈관 내피 세포의 유도, 확장, 냉동 보존 및 특성화. J. Vis. 특급 (2020)

이 동영상은 인간 iPSC를 뇌 미세혈관 내피 세포로 분화하는 다단계 과정을 보여줍니다. 이렇게 분화된 세포는 긴밀한 연접을 특징으로 하는 뇌 미세혈관 내피 세포를 밀접하게 모방하여 뇌 질환 연구에 이상적입니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 간단히 말해서, 섬유아세포는 mRNA 기반 유전자 재프로그래밍을 통해 iPSC로 재프로그래밍되었습니다. iPSC는 줄기세포 배지(SCM)(재료 목록 참조)에서 유지되었으며 -160°C에서 액체 질소의 동결 보존된 바이알에 SCM 1mL, rho-associated protein kinase inhibitor (ROCKi) Y-27632가 있는 10μM 및 10%(v/v) dimethyl sulfide(DMSO)와 함께 ~1.2 x 10² cells/mL의 밀도로 보관되었습니다. 아래의 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 생물 안전 작업대에서 수행됩니다.

1. 기저막 매트릭스 희석 및 플레이트 코팅

1. 페놀 레드가 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 Engelbreth-Holm-Swarm 종양에서 정제된 희석(1:50) 성장 인자 감소 기저막 매트릭스.
2. 세포 배양 플레이트를 적당량의 희석된 기저막 매트릭스(즉, 6-well plate = 1mL, 12-well plate = 0.5 mL)로 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

2. 유도만능줄기세포(iPSC) 유지 관리

참고: 6웰 평면 바닥 플레이트에서 웰당 최대 합류도는 ~1.2 x 10⁶ 셀입니다.

1. 동결 보존된 iPSC를 10μM Y-27632로 SCM으로 해동하고 희석된 성장 인자 감소 기저막 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트에 플레이트를 만듭니다.
2. 해동 후 처음 24시간 동안 10μM Y-27632로 SCM에서 iPSC를 유지합니다. 24시간 후에 새 배지로 교체하십시오.
3. 세포가 80-90% 포화도에 도달할 때까지 SCM에서 iPSC를 유지한 후 통과시킵니다.
   1. 분화를 위해 원하는 밀도(15,600 cells/cm2)에 웰의 표면적을 곱하여 분화에 필요한 iPSC의 수를 계산합니다. 6-well flat-bottom plate의 경우 15,600 cells/cm² 에 9.6 cm²를 곱하여 총 149,760 cells/well을 만듭니다.
4. 통로를 이용하려면 행크스의 균형 염 용액(HBBS)으로 세포를 세척하십시오. 그런 다음 37°C에서 5분 동안 비효소성 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(재료 목록 참조)으로 세포를 배양합니다.
   1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 들어 올립니다. 새로운 SCM에서 세포를 수집합니다.
   2. 희석된 SCM으로 코팅된 세포 배양 플레이트에 세포를 플레이트화하고 2.3단계에서 설명한 대로 세포를 유지하거나 -160°C의 온도에서 액체 질소의 동결 보존 바이알에 1mL의 SCM, 10μM Y-27632 및 10% DMSO(v/v)의 ~1.2 x 10 6 cells/mL로 보관합니다.

3. iPSC와 BMEC의 차별화

참고: 비효소 EDTA는 세포를 덩어리로 분리합니다. Enzymatic EDTA(Table of Materials 참조)는 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 레티노산(RA)은 빛으로부터 보호해야 합니다.

1. 둘베코의 인산염 완충액 식염수(DPBS)로 iPSC를 한 번 세척합니다. 효소 EDTA(6웰 플레이트의 경우 1mL, 12웰 플레이트의 경우 0.5mL, 24웰 플레이트의 경우 0.25mL)를 37°C에서 약 5분 동안 배양하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
2. 세포를 모으고 실온에서 5분 동안 300 x g(상대 원심력)로 원심분리합니다. 10μM Y-27632를 함유하는 SCM에서 세포 펠릿을 재현탁합니다.
3. Trypan Blue와 자동 세포 계수기 또는 혈구계 장치를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 24시간 동안 10μM Y-27632를 포함하는 SCM에서 6웰 평면 바닥 플레이트(표면적 9.6cm2/웰)의 15,600셀/^cm2 또는 149,760셀/웰의 밀도를 갖는 플레이트 셀.
4. 24시간 후 SCM을 E6 매체로 변경하여 차별화를 시작합니다. 다음 4일 동안 매일 E6 매체를 변경합니다.
5. 분화 4일차에 E6 배지를 희석된(1:200) B27 보충제, 20ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 10μM RA가 보충된 인간 내피 무혈청 배지(hESFM)로 교체합니다. 앞으로 48시간 동안은 이 매체를 변경하지 마십시오.
6. 200mL의 hESFM을 희석된(1:200) B27과 함께 준비하고, 1mL의 50x 농축 B27 보충제를 199mL의 hESFM에 혼합합니다.
7. 250μL의 Tris 완충액(5mM Tris, pH 7.6, 150mMsodium chloride, NaCl)에 50μg의 bFGF를 재구성하여 20ng/mL의 bFGF를 준비하여 200μg/mL의 원액을 만듭니다. 20 μL의 200 μg/mL bFGF와 200 mL의 hESFM을 혼합하여 20 ng/mL bFGF를 함유하는 200 mL의 hESFM을 준비합니다.
8. RA 분말 100mg에 DMSO 2.5mL를 첨가하여 40mg/mL의 RA 원액을 먼저 만들어 10μM RA를 준비합니다. 이 농도를 3mg/mL로 희석하여 10mM 원액을 만듭니다. 200mL hESFM에 200μL의 10μM RA를 혼합하여 10μM RA를 포함하는 200mL의 hESFM을 준비합니다.

4. iPSC 유래 BMEC 정제를 위한 콜라겐 IV(COL4) 및 피브로넥틴(FN) 매트릭스 코팅

1. 2mg의 FN에 2mL의 멸균수를 추가하여 1mg/mL FN 원액을 만듭니다. 5mg의 COL4에 멸균수 5mL를 추가하여 1mg/mL의 COL4 원액을 만듭니다.
   1. FN은 37°C에서 최소 30분 동안 용해되고 COL4는 실온에서 용해되도록 합니다.
2. FN 원액을 멸균수에서 최종 농도 100μg/mL로 희석하고 COL4 원액을 최종 농도 400μg/mL로 희석합니다.
3. 원하는 플레이트(6-well plate = 1mL의 COL4/FN 용액, 12-well plate = 0.5mL, 24-well plate= 0.25mL 및 12-transwell filtered plate = 0.25 mL)를 400 μg/mL COL4 및 100 μg/mL FN의 혼합물로 코팅합니다.
4. 플레이트를 최소 2시간 동안 배양하거나 37°C에서 밤새 배양합니다. Transwell 여과 플레이트의 경우 최소 4시간이 권장됩니다.

5. iPSC 유래 BMEC의 하위 배양 및 정제

참고: 효소 EDTA를 사용한 배양은 분화 6일차에 세포의 포화도에 따라 15분 이상 걸릴 수 있습니다.

1. 분화 6일차에 DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 37°C에서 최소 15분 동안 1mL의 효소 EDTA로 배양합니다.
2. 실온에서 5분 동안 300 x g의 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 희석된(1:200) B27 보충제, 20ng/mL bFGF 및 10μM RA를 함유한 새로운 hESFM으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
3. 400μg/mL COL4 및 100μg/mL FN의 혼합물로 코팅된 플레이트에 종자 세포. 6웰 플레이트의 1웰과 12웰 플레이트의 3웰, 12-트랜스웰 여과 플레이트의 3웰 또는 24웰 플레이트의 6웰의 비율을 사용하는 시드 셀.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아카쿠타아제	시그마 알드리치	A6964-100mL
B27 보충제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044
인간 태반에서 추출한 콜라겐 IV	시그마 알드리치	C5533-5mg
Corning 2 mL 내부 나사산 폴리프로필렌 극저온 바이알	코 닝	8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)	코 닝	353046
DMEM/F12 (페놀 레드 제외)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1413202
디엠소	시그마 알드리치	D2438-50mL
DPBS (+/+)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14040-117
필수 6 매체 (Thermo Fisher)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1516401
피브로넥틴	시그마 알드리치	F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free 성장 인자 감소 기저막 매트릭스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1413202
Hanks' Balance 칼슘과 마그네슘을 함유한 솔트 솔루션	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제24020-117
인간 내피 무혈청 배지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11111044
Invitrogen Countess 자동 세포 계수기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	해당 사항 없음
레티노산	시그마 알드리치	R2625-100MG
Y-27632 이염산염 (ROCK 억제제)	Tocris/Thermo Fisher Scientific	1254
Countess Automated Cell Counter와 함께 사용하기 위한 Trypan Blue Stain(0.4%)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	T10282

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