$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 간단히 말해서, 섬유아세포는 mRNA 기반 유전자 재프로그래밍을 통해 iPSC로 재프로그래밍되었습니다. iPSC는 줄기세포 배지(SCM)(재료 목록 참조)에서 유지되었으며 -160°C에서 액체 질소의 동결 보존된 바이알에 SCM 1mL, rho-associated protein kinase inhibitor (ROCKi) Y-27632가 있는 10μM 및 10%(v/v) dimethyl sulfide(DMSO)와 함께 ~1.2 x 102 cells/mL의 밀도로 보관되었습니다. 아래의 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 생물 안전 작업대에서 수행됩니다.
1. 기저막 매트릭스 희석 및 플레이트 코팅
- 페놀 레드가 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 Engelbreth-Holm-Swarm 종양에서 정제된 희석(1:50) 성장 인자 감소 기저막 매트릭스.
- 세포 배양 플레이트를 적당량의 희석된 기저막 매트릭스(즉, 6-well plate = 1mL, 12-well plate = 0.5 mL)로 코팅하고 37°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
2. 유도만능줄기세포(iPSC) 유지 관리
참고: 6웰 평면 바닥 플레이트에서 웰당 최대 합류도는 ~1.2 x 106 셀입니다.
- 동결 보존된 iPSC를 10μM Y-27632로 SCM으로 해동하고 희석된 성장 인자 감소 기저막 매트릭스로 코팅된 6웰 플레이트에 플레이트를 만듭니다.
- 해동 후 처음 24시간 동안 10μM Y-27632로 SCM에서 iPSC를 유지합니다. 24시간 후에 새 배지로 교체하십시오.
- 세포가 80-90% 포화도에 도달할 때까지 SCM에서 iPSC를 유지한 후 통과시킵니다.
- 분화를 위해 원하는 밀도(15,600 cells/cm2)에 웰의 표면적을 곱하여 분화에 필요한 iPSC의 수를 계산합니다. 6-well flat-bottom plate의 경우 15,600 cells/cm2 에 9.6 cm2를 곱하여 총 149,760 cells/well을 만듭니다.
- 통로를 이용하려면 행크스의 균형 염 용액(HBBS)으로 세포를 세척하십시오. 그런 다음 37°C에서 5분 동안 비효소성 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(재료 목록 참조)으로 세포를 배양합니다.
- 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 들어 올립니다. 새로운 SCM에서 세포를 수집합니다.
- 희석된 SCM으로 코팅된 세포 배양 플레이트에 세포를 플레이트화하고 2.3단계에서 설명한 대로 세포를 유지하거나 -160°C의 온도에서 액체 질소의 동결 보존 바이알에 1mL의 SCM, 10μM Y-27632 및 10% DMSO(v/v)의 ~1.2 x 10 6 cells/mL로 보관합니다.
3. iPSC와 BMEC의 차별화
참고: 비효소 EDTA는 세포를 덩어리로 분리합니다. Enzymatic EDTA(Table of Materials 참조)는 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 레티노산(RA)은 빛으로부터 보호해야 합니다.
- 둘베코의 인산염 완충액 식염수(DPBS)로 iPSC를 한 번 세척합니다. 효소 EDTA(6웰 플레이트의 경우 1mL, 12웰 플레이트의 경우 0.5mL, 24웰 플레이트의 경우 0.25mL)를 37°C에서 약 5분 동안 배양하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 세포를 모으고 실온에서 5분 동안 300 x g(상대 원심력)로 원심분리합니다. 10μM Y-27632를 함유하는 SCM에서 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- Trypan Blue와 자동 세포 계수기 또는 혈구계 장치를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 24시간 동안 10μM Y-27632를 포함하는 SCM에서 6웰 평면 바닥 플레이트(표면적 9.6cm2/웰)의 15,600셀/cm2 또는 149,760셀/웰의 밀도를 갖는 플레이트 셀.
- 24시간 후 SCM을 E6 매체로 변경하여 차별화를 시작합니다. 다음 4일 동안 매일 E6 매체를 변경합니다.
- 분화 4일차에 E6 배지를 희석된(1:200) B27 보충제, 20ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 10μM RA가 보충된 인간 내피 무혈청 배지(hESFM)로 교체합니다. 앞으로 48시간 동안은 이 매체를 변경하지 마십시오.
- 200mL의 hESFM을 희석된(1:200) B27과 함께 준비하고, 1mL의 50x 농축 B27 보충제를 199mL의 hESFM에 혼합합니다.
- 250μL의 Tris 완충액(5mM Tris, pH 7.6, 150mMsodium chloride, NaCl)에 50μg의 bFGF를 재구성하여 20ng/mL의 bFGF를 준비하여 200μg/mL의 원액을 만듭니다. 20 μL의 200 μg/mL bFGF와 200 mL의 hESFM을 혼합하여 20 ng/mL bFGF를 함유하는 200 mL의 hESFM을 준비합니다.
- RA 분말 100mg에 DMSO 2.5mL를 첨가하여 40mg/mL의 RA 원액을 먼저 만들어 10μM RA를 준비합니다. 이 농도를 3mg/mL로 희석하여 10mM 원액을 만듭니다. 200mL hESFM에 200μL의 10μM RA를 혼합하여 10μM RA를 포함하는 200mL의 hESFM을 준비합니다.
4. iPSC 유래 BMEC 정제를 위한 콜라겐 IV(COL4) 및 피브로넥틴(FN) 매트릭스 코팅
- 2mg의 FN에 2mL의 멸균수를 추가하여 1mg/mL FN 원액을 만듭니다. 5mg의 COL4에 멸균수 5mL를 추가하여 1mg/mL의 COL4 원액을 만듭니다.
- FN은 37°C에서 최소 30분 동안 용해되고 COL4는 실온에서 용해되도록 합니다.
- FN 원액을 멸균수에서 최종 농도 100μg/mL로 희석하고 COL4 원액을 최종 농도 400μg/mL로 희석합니다.
- 원하는 플레이트(6-well plate = 1mL의 COL4/FN 용액, 12-well plate = 0.5mL, 24-well plate= 0.25mL 및 12-transwell filtered plate = 0.25 mL)를 400 μg/mL COL4 및 100 μg/mL FN의 혼합물로 코팅합니다.
- 플레이트를 최소 2시간 동안 배양하거나 37°C에서 밤새 배양합니다. Transwell 여과 플레이트의 경우 최소 4시간이 권장됩니다.
5. iPSC 유래 BMEC의 하위 배양 및 정제
참고: 효소 EDTA를 사용한 배양은 분화 6일차에 세포의 포화도에 따라 15분 이상 걸릴 수 있습니다.
- 분화 6일차에 DPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 37°C에서 최소 15분 동안 1mL의 효소 EDTA로 배양합니다.
- 실온에서 5분 동안 300 x g의 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 희석된(1:200) B27 보충제, 20ng/mL bFGF 및 10μM RA를 함유한 새로운 hESFM으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 400μg/mL COL4 및 100μg/mL FN의 혼합물로 코팅된 플레이트에 종자 세포. 6웰 플레이트의 1웰과 12웰 플레이트의 3웰, 12-트랜스웰 여과 플레이트의 3웰 또는 24웰 플레이트의 6웰의 비율을 사용하는 시드 셀.