Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

초록

출처: Sanchez, K. R., et al., 다중 전극 배열을 사용하여 척추 동물 신경망 기능 개발에 대한 내분비 교란 화합물의 영향 평가. J. Vis. 특급.(2018년)

이 비디오는 초기 단계의 병아리 배아의 전뇌에서 뉴런을 분리하고 미세 전극 어레이에서 배양하여 뉴런 네트워크를 형성하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 머티리얼 셋업

1. 37°C의 시판되는 탁상용 난자 인큐베이터에서 병아리 알을 부화합니다. E7 배아의 경우 7일 동안 알을 부화합니다.
2. 다중 전극 어레이(MEA)를 준비합니다. 필요한 수의 MEA를 70% 에탄올에 3-4시간 동안 담근 다음 생물 안전 레벨-II(BSLII) 후드에서 약 10mL의 멸균 증류수에 3회 헹궈 MEA를 멸균합니다.
   메모: MEA에는 8 x 8 그리드에 배열된 64개의 나노다공성 백금 전극이 포함되어 있습니다. 전극 직경은 30μm이고 전극 사이의 간격은 200μm입니다. MEA를 살균하기 위해 변성 에탄올을 사용하면 부식이 발생할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
3. MEA를 뚜껑이 있는 멸균 용기 안에 넣고(멸균 상태를 유지하기 위해) 탁상용 인큐베이터로 이동합니다. 55 °C에서 최소 6 시간 동안 굽습니다. 이 단계는 적절한 멸균에 매우 중요하며 온도는 60°C를 초과해서는 안 됩니다. 멸균 상태를 유지하려면 MEA가 들어있는 접시를 BSLII 후드로 옮겨 나중에 사용할 때까지 보관하십시오.
   메모: 플라스틱 뚜껑이 있는 오븐용 유리 베이킹 접시를 사용하고 70% 에탄올로 표면 살균하고 BSLII 후드에 넣어 건조시킵니다.
4. 세포외 기질(ECM) 용액을 분취합니다. 바이알을 4°C에서 밤새 해동하고 -20°C에서 100μL 분취량을 동결합니다.
   메모: ECM은 냉동 상태로 배송됩니다. 실온에서 중합되고 중합되면 코팅이 불가능하므로 코팅할 준비가 될 때까지 실온으로 가져와서는 안 됩니다. 성장 인자가 없는 ECM은 알 수 없는 인자로 인한 추가 효과를 방지하기 위해 선호됩니다.
5. 모든 해부 기구(Dumont #5 집게, 곡선 집게, 작은 가위, 스프링 가위)와 자체 밀봉 재료 코팅된 해부 접시를 70% 에탄올로 소독하고 해부 후드에서 건조시킵니다.

2. 병아리 배아 뉴런 배양 및 네트워크 활동

1. 도금 당일, -20°C 냉동고에서 ECM 바이알을 꺼내 70% 에탄올을 분사한 후 얼음 위에 올려 놓습니다. BSLII 후드 내부에 300μL의 차가운 신경기저 배지를 첨가하여 25%로 희석합니다.
2. P200 피펫맨을 사용하여 전극을 건드리지 않도록 주의하면서 MEA 중앙에 100μL의 25% ECM을 첨가하고 즉시 제거하여 표면에 박막을 남깁니다. MEA를 덮고 뉴런을 플레이트링할 준비가 될 때까지 CO₂ 인큐베이터(37°C 및 5% CO₂)에 넣습니다.
3. E7 난자(배아 7일째, 37°C에서 7일 동안 배양)의 외부 껍질을 70% 에탄올로 살균합니다. 칼슘이 없는 냉간 멸균 Hank's Balanced Salts Solution(HBSS)이 들어 있는 Sylgard 바닥 해부 접시에 배아의 목을 베십시오. 눈 주위를 자르고 안구를 제거합니다. DuMont #5 가는 집게와 용수철 가위를 사용하여 복부 쪽을 절개하고 피부의 바깥층을 제거하여 전뇌와 시신경을 노출시킵니다. pial membrane을 조심스럽게 벗겨 제거하십시오. 전뇌를 다른 페트리 접시에 옮기고 스프링 가위로 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다.
   메모: pial membrane 제거 후 전뇌에 혈관이 부착되어 있지 않아야 합니다. 가능한 경우, 멸균 박리 후드에서 박리를 수행하는 것이 바람직하지만, 기구와 박리 영역이 70% 에탄올로 철저히 멸균되는 한 후드 밖에서 박리를 수행할 때 상당히 좋은 결과를 얻었습니다.
4. 멸균 이송 피펫을 사용하여 전뇌 조각을 15mL 원심분리 튜브에 모으고 원심분리기 튜브 바닥으로 가라앉힌 후 HBSS를 최대한 제거합니다.
5. 0.05% 트립신/에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신/EDTA) 1mL(37°C로 예열)를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 조각을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 제거하고 1mL의 신경 기저 배지를 추가합니다. 조직 조각을 바닥으로 가라앉히고 매체를 제거합니다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 이 단계는 트립신/EDTA를 씻어내는 것입니다.
7. neurobasal 배지 2mL를 추가하고 분쇄를 시작합니다. 트리추레이션(Trituration)은 멸균된 불광택 파스퇴르 피펫을 가져다가 더 이상 조각이 보이지 않을 때까지 조직을 여러 번 부드럽게 통과시키는 것을 포함합니다. 반복해서 통과한 후에도 조각이 남아 있으면 바닥에 가라앉도록 그대로 두십시오.
   메모: 트리츄레이션하는 동안 거품을 일으키지 마십시오 - 거품이 형성되면 멈추고 흡인으로 제거하십시오.
8. 다시 부유한 세포를 neurobasal medium으로 1:10으로 희석하고 Trypan Blue 염료와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 0.5mL 원심분리 튜브에 50μL의 희석된 세포와 50μL의 Trypan Blue 용액을 혼합합니다. 커버슬립에 놓은 후 혈구계에 10μL를 추가하고 밝고 투명한 세포를 계수합니다(파란색 세포는 죽었으므로 계수해서는 안 됨).
   메모: 단일 E7 광학 tectum의 일반적인 세포 수는 1 - 5 x 10⁷ cells/mL 사이입니다.
9. ECM 코팅된 MEA에서 해리된 세포를 2,200 cells/square mm의 밀도로 플레이트링합니다. MEA 시스템의 경우 이는 MEA당 약 130,000개의 셀에 해당합니다. neurobasal 배지를 추가하여 MEA의 부피를 1mL로 가져오고 세포 부착 및 신경돌기 확장을 위해 MEA를 CO₂ 인큐베이터에 밤새 배치합니다(그림 1).
   메모: 서로 다른 영역과 전극 수의 MEA의 경우 다른 세포 밀도를 시도할 수 있으며, 일반적으로 세포 밀도가 높을수록 네트워크 활성이 커지지만 배양 수명이 짧아
지기도 합니다.

결과

그림 1: 병아리 전뇌 해부부터 네트워크 활동의 해리, 도금 및 기록에 이르는 단계를 묘사하는 프로토콜의 개략도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#5 포셉스	정밀 과학 도구	11251-10
액시온 뮤즈 MEA	액시온 바이오시스템즈	M64-GL1-30PT200
곡선형 집게	정밀 과학 도구	11272-50
에탄올	시그마-알드리치	64-17-5
HBSS (하이브에스)	어부	14170112
혈구계	어부	02-671-6
Matrigel 성장 인자 감소, 페놀 레드 프리	BD 바이오사이언스	356231
Neurobasal 배지	브레인비츠	NB4-500
파스퇴르 피펫	어부	13-678-20ᅡ
봄 가위	정밀 과학 도구	15514-12
실가드 바닥 해부 접시	리빙 시스템 인스트루먼트(Living Systems Instrumentaion)	DD-90-S-BLK-3PK
트리판 블루 염료	어부	Tel.: 15-250-061
트립신-EDTA	어부	15400054

년 년 호 (영문) 년