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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 머티리얼 셋업
- 37°C의 시판되는 탁상용 난자 인큐베이터에서 병아리 알을 부화합니다. E7 배아의 경우 7일 동안 알을 부화합니다.
- 다중 전극 어레이(MEA)를 준비합니다. 필요한 수의 MEA를 70% 에탄올에 3-4시간 동안 담근 다음 생물 안전 레벨-II(BSLII) 후드에서 약 10mL의 멸균 증류수에 3회 헹궈 MEA를 멸균합니다.
메모: MEA에는 8 x 8 그리드에 배열된 64개의 나노다공성 백금 전극이 포함되어 있습니다. 전극 직경은 30μm이고 전극 사이의 간격은 200μm입니다. MEA를 살균하기 위해 변성 에탄올을 사용하면 부식이 발생할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- MEA를 뚜껑이 있는 멸균 용기 안에 넣고(멸균 상태를 유지하기 위해) 탁상용 인큐베이터로 이동합니다. 55 °C에서 최소 6 시간 동안 굽습니다. 이 단계는 적절한 멸균에 매우 중요하며 온도는 60°C를 초과해서는 안 됩니다. 멸균 상태를 유지하려면 MEA가 들어있는 접시를 BSLII 후드로 옮겨 나중에 사용할 때까지 보관하십시오.
메모: 플라스틱 뚜껑이 있는 오븐용 유리 베이킹 접시를 사용하고 70% 에탄올로 표면 살균하고 BSLII 후드에 넣어 건조시킵니다.
- 세포외 기질(ECM) 용액을 분취합니다. 바이알을 4°C에서 밤새 해동하고 -20°C에서 100μL 분취량을 동결합니다.
메모: ECM은 냉동 상태로 배송됩니다. 실온에서 중합되고 중합되면 코팅이 불가능하므로 코팅할 준비가 될 때까지 실온으로 가져와서는 안 됩니다. 성장 인자가 없는 ECM은 알 수 없는 인자로 인한 추가 효과를 방지하기 위해 선호됩니다.
- 모든 해부 기구(Dumont #5 집게, 곡선 집게, 작은 가위, 스프링 가위)와 자체 밀봉 재료 코팅된 해부 접시를 70% 에탄올로 소독하고 해부 후드에서 건조시킵니다.
2. 병아리 배아 뉴런 배양 및 네트워크 활동
- 도금 당일, -20°C 냉동고에서 ECM 바이알을 꺼내 70% 에탄올을 분사한 후 얼음 위에 올려 놓습니다. BSLII 후드 내부에 300μL의 차가운 신경기저 배지를 첨가하여 25%로 희석합니다.
- P200 피펫맨을 사용하여 전극을 건드리지 않도록 주의하면서 MEA 중앙에 100μL의 25% ECM을 첨가하고 즉시 제거하여 표면에 박막을 남깁니다. MEA를 덮고 뉴런을 플레이트링할 준비가 될 때까지 CO2 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에 넣습니다.
- E7 난자(배아 7일째, 37°C에서 7일 동안 배양)의 외부 껍질을 70% 에탄올로 살균합니다. 칼슘이 없는 냉간 멸균 Hank's Balanced Salts Solution(HBSS)이 들어 있는 Sylgard 바닥 해부 접시에 배아의 목을 베십시오. 눈 주위를 자르고 안구를 제거합니다. DuMont #5 가는 집게와 용수철 가위를 사용하여 복부 쪽을 절개하고 피부의 바깥층을 제거하여 전뇌와 시신경을 노출시킵니다. pial membrane을 조심스럽게 벗겨 제거하십시오. 전뇌를 다른 페트리 접시에 옮기고 스프링 가위로 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다.
메모: pial membrane 제거 후 전뇌에 혈관이 부착되어 있지 않아야 합니다. 가능한 경우, 멸균 박리 후드에서 박리를 수행하는 것이 바람직하지만, 기구와 박리 영역이 70% 에탄올로 철저히 멸균되는 한 후드 밖에서 박리를 수행할 때 상당히 좋은 결과를 얻었습니다.
- 멸균 이송 피펫을 사용하여 전뇌 조각을 15mL 원심분리 튜브에 모으고 원심분리기 튜브 바닥으로 가라앉힌 후 HBSS를 최대한 제거합니다.
- 0.05% 트립신/에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신/EDTA) 1mL(37°C로 예열)를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 조각을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 제거하고 1mL의 신경 기저 배지를 추가합니다. 조직 조각을 바닥으로 가라앉히고 매체를 제거합니다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오. 이 단계는 트립신/EDTA를 씻어내는 것입니다.
- neurobasal 배지 2mL를 추가하고 분쇄를 시작합니다. 트리추레이션(Trituration)은 멸균된 불광택 파스퇴르 피펫을 가져다가 더 이상 조각이 보이지 않을 때까지 조직을 여러 번 부드럽게 통과시키는 것을 포함합니다. 반복해서 통과한 후에도 조각이 남아 있으면 바닥에 가라앉도록 그대로 두십시오.
메모: 트리츄레이션하는 동안 거품을 일으키지 마십시오 - 거품이 형성되면 멈추고 흡인으로 제거하십시오.
- 다시 부유한 세포를 neurobasal medium으로 1:10으로 희석하고 Trypan Blue 염료와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 0.5mL 원심분리 튜브에 50μL의 희석된 세포와 50μL의 Trypan Blue 용액을 혼합합니다. 커버슬립에 놓은 후 혈구계에 10μL를 추가하고 밝고 투명한 세포를 계수합니다(파란색 세포는 죽었으므로 계수해서는 안 됨).
메모: 단일 E7 광학 tectum의 일반적인 세포 수는 1 - 5 x 107 cells/mL 사이입니다.
- ECM 코팅된 MEA에서 해리된 세포를 2,200 cells/square mm의 밀도로 플레이트링합니다. MEA 시스템의 경우 이는 MEA당 약 130,000개의 셀에 해당합니다. neurobasal 배지를 추가하여 MEA의 부피를 1mL로 가져오고 세포 부착 및 신경돌기 확장을 위해 MEA를 CO2 인큐베이터에 밤새 배치합니다(그림 1).
메모: 서로 다른 영역과 전극 수의 MEA의 경우 다른 세포 밀도를 시도할 수 있으며, 일반적으로 세포 밀도가 높을수록 네트워크 활성이 커지지만 배양 수명이 짧아 지기도 합니다.
