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1. iPSC 유래 신경전구세포(iNPC) 생성
- 아래에 설명된 대로 그리고 이전에 발표된 바와 같이 iPSC 콜로니에서 EZ-sphere를 생성합니다.
- mTESR1 또는 기타 상용 매체에서 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트(0.5mg/플레이트)에 iPSC 콜로니를 배양하여 융합시킵니다(재료 표 참조).
- iPSC 배지를 제거하고 2mL의 EZ-sphere 배지[ESM; DMEM:F12 7:3에는 100ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 100ng/mL 표피 성장 인자, 5μg/mL 헤파린 및 2% B27 보충제가 보충됩니다.
- 멸균 1000μL 피펫 팁 또는 셀 스크레이퍼의 뒷면으로 각 합류부의 바닥을 긁어냅니다.
- 모든 세포를 모아 초저 부착 T25 플라스크에 넣어 자유롭게 떠다니는 구체가 자발적으로 형성될 수 있도록 합니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다.
- 배지가 노랗게 변할 때 2-3일마다 배지의 절반을 새 ESM으로 교체하여 구체에 공급합니다. 이를 통해 구체는 조건화된 매체에 남아 있을 수 있으며, 이는 구체의 성장과 유지에 매우 중요합니다.
- 플라스크를 튜브 랙에 기대어 구체가 플라스크 모서리까지 1-2분 동안 중력에 의해 가라앉도록 합니다.
- 침전이 완료되면 5 mL 또는 10 mL 혈청 피펫으로 상층액의 절반을 흡인하고 예열된 신선한 ESM으로 교체합니다.
- 앞에서 설명한 대로 구체를 200μm 직경으로 절단하여 매주 EZ-sphere를 통과합니다. EZ-sphere는 최대 25개의 통로 동안 유지될 수 있으며 8-25개의 통로 사이에 사용할 때 이상적입니다.
- iNPC의 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 신경 분화를 유도하려면 EZ-sphere를 단일 세포로 해리합니다.
- T75 플라스크에서 다진 후 3-4일 후에 구체를 모아 15mL 원뿔형으로 옮긴 다음 2분 동안 또는 모든 구체가 바닥에 가라앉을 때까지 그대로 둡니다.
- 침전된 구체를 방해하지 않고 5mL 피펫으로 ESM을 천천히 제거합니다. 해리 용액 1mL(재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 배양 5분 후 해리 용액과 구체를 소용돌이쳐 침전된 구체가 처리되었는지 확인합니다.
- 해리 용액을 천천히 제거합니다. 1mL의 신경 분화 배지[NDM; DMEM: F12, B27 2% - 비타민 A, N2 보충제 1%, 인간 뇌 유래 신경 영양 인자(hBDNF, 20ng/mL)].
- 모든 구가 해리될 때까지 1 mL 피펫을 사용한 후 200 μL 피펫을 사용하여 구를 단일 세포로 분쇄합니다. trituration 절차 중 기포 형성을 피하십시오.
- 혈구계를 사용하여 해리된 세포를 계수하고 세포를 1 x 106 cells/mL의 최종 밀도로 희석합니다. 응용 프로그램에 따라 밀도를 변경할 수 있습니다.
메모: 최대 3일의 단기 배양에는 더 높은 밀도(최대 6 x 106 cells/mL)가 권장되며, 최대 3주의 장기 배양에는 더 낮은 밀도가 권장됩니다.
메모: 세포는 이제 "뇌 쪽"을 형성하기 위해 칩의 상단 채널로 파종할 준비가 되었습니다.
2. iPSC를 iBMEC로 차별화
- 6웰 플레이트의 단일 합류 웰에서 1:6 비율로 6웰 기저 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트로 iPSC를 통과시킵니다. 세포가 24시간 동안 부착되도록 합니다. iPSC 배지를 매일 교체하십시오.
- 혈구계를 사용하여 매일 세포를 계수합니다.
- 세포의 밀도가 1.5–3.0 x 105 cells/well에 도달하면 iPSC 배지를 bFGF가 없는 3mL의 무조건 배지로 교체합니다[DMEM:F12 1:1, 10% 녹아웃 혈청 대체제(KOSR), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 0.5% 글루타민 보충제(Table of Materials) 및 100μM β-메르캅토에탄올]. 6일 동안 매일 배지를 교체하십시오.
- 6일차에 배지를 내피 세포(EC) 배지[1% 혈소판 부족 혈장 유래 소 혈청, 20ng/mL bFGF 및 10μM all-trans 레티노산(RA)이 보충된 인간 내피 혈청 무함유 배지(hESFM)]로 교체합니다. 매체를 2일 동안 그대로 두십시오.
- EC 배지를 제거하고 웰당 1mL의 해리 용액을 추가합니다. 37 °C에서 35 분 동안 배양하십시오 .
메모: 여기에 사용된 해리 용액에서는 배양 시간이 긴 것으로 간주되지만, iBMEC는 90% 이상의 세포 생존율로 이러한 처리를 견딜 수 있습니다.
- 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하고 모든 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모아 웰에서 세포를 분리합니다.
메모: 거친 피펫팅을 피하십시오. 세포가 쉽게 분리되지 않으면 5분 더 배양합니다.
- 15mL 코니컬에 EC 배지 1개를 추가하여 Accutase를 비활성화하고, 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 배지를 제거하고 1mL의 EC 배지(bFGF 및 RA 제외)로 교체합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산하고 세포 밀도를 14–20 x 106 cells/mL.
로 조정합니다.
메모: 이제 세포는 칩의 하단 채널로 파종되어 "혈액 측"을 형성할 준비가 되었습니다.
3. 장기 칩의 미세 가공
- 이전과 마찬가지로 BBB 칩 모델 및 생산에 장기 칩을 사용합니다. 톨 채널 기관 칩(재료 표 참조)은 유연한 다공성 멤브레인으로 분리된 두 개의 중첩 및 병렬 마이크로 스케일 채널을 포함하는 매우 유연한 폴리디메틸실록산(PDMS) 엘라스토머로 제작됩니다. 상단 및 하단 마이크로 채널 크기는 각각 1mm x 1mm 및 1.0mm x 0.2mm입니다. 두 채널은 40μm 간격의 7μm 직경 기공을 포함하는 50μm 두께의 PDMS로 만든 유연한 다공성 멤브레인으로 분리됩니다. 채널을 분리하는 다공성 막의 표면적은 0.171cm2입니다.
4. 칩 준비
- 장기 칩은 칩 캐리어 내에 미리 포장되어 제공되므로 취급 중에 칩 정렬을 방해하거나 왜곡할 필요가 없습니다. 또한, 칩 캐리어는 배양 모듈과 칩 사이의 인터페이스 역할을 하는 휴대용 모듈("Pod")에 안전하게 연결됩니다.
- 칩 포장에 70% 에탄올을 분사하고 생물 안전 캐비닛(BSC)으로 가져옵니다.
- 포장을 열고 멸균 페트리 접시에 오르간 칩을 놓습니다. 칩과의 직접적인 접촉을 피하기 위해 칩 캐리어를 측면으로만 다루십시오.
- 캐리어의 탭이 오른쪽을 향하고 있는지(그림 1) 여러 칩을 사용하는 경우 모두 같은 방향으로 정렬합니다.
- 캐리어 탭의 각 칩에 레이블을 지정합니다(전체 칩 준비 및 워크플로는 그림 2에 나와 있음).
5. 표면 활성화 및 ECM 코팅
- 표면 활성화 용액의 준비
- 5mg이 들어있는 바이알에 제공되는 에뮬레이트 시약 1(ER-1)은 빛에 민감합니다. 사용하기 직전에 새로운 ER-1 용액을 준비하십시오. ER-1 무결성은 칩을 성공적으로 준비하는 데 매우 중요합니다.
- ER-1.
를 처리할 때 BSC의 조명을 끕니다.
메모: ER-1은 눈을 자극하므로 적절한 장갑과 보안경과 함께 BSC에서 취급해야 합니다.
- 사용하기 전에 ER-1 및 ER-2 시약이 실온(RT)과 평형을 이루도록 합니다.
- 빈 멸균 15mL 원뿔형 튜브를 호일로 감싸 용액을 빛으로부터 보호합니다.
- BSC에서 ER-1 바이알을 짧게 두드려 바닥에 분말을 가라앉힙니다.
- 바이알에 ER-2 완충액 1mL를 추가하고 내용물을 15mL로 감싼 원뿔형 튜브의 바닥으로 즉시 옮깁니다. 혼합하기 위해 피펫을 사용하지 마십시오. 원뿔형 튜브로 옮겨진 용액의 색상은 빨간색입니다.
- 5.1.6 3x 단계를 반복합니다. 마지막 라운드에서 ER-1 바이알의 캡을 씌우고 뒤집어 뚜껑에 남아 있는 분말을 모은 다음 용액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 이렇게 하면 총 부피가 4mL의 ER-1 용액이 됩니다.
- 6mL 원뿔형 튜브에 있는 4mL의 ER-1 용액에 ER-2 용액 1mL를 최종 농도 0.5mg/mL로 추가합니다. ER-1은 ER-2 솔루션 내에서 완전히 용해되어야 합니다.
- 표면 활성화
- P200 피펫과 멸균 200 μL 여과 피펫 팁을 사용하여 200 μL의 ER-1 혼합물을 흡수합니다.
- 피펫을 하단 입구에 놓고 혼합물이 하단 채널 배출구에서 흘러나오기 시작할 때까지 하단 채널을 통해 20μL의 ER-1 혼합물을 밀어 넣습니다.
- 약 50μL의 ER-1 혼합물을 첨가하고 상단 채널 주입구에 놓습니다. 혼합물이 상단 채널 배출구에서 흘러나오기 시작할 때까지 상단 채널을 통해 혼합물을 밀어 넣습니다.
- 부드러운 흡인으로 칩 표면에서 과도한 ER-1 혼합물을 모두 제거합니다. ER-1 혼합물이 채널이 아닌 칩 표면에서만 제거되었는지 확인하십시오.
- 자외선(UV)이 활성화되기 전에 채널에 기포가 없는지 확인합니다. 기포가 감지되면 ER-1 혼합물로 채널을 세척하여 기포를 제거하십시오.
- 칩이 들어 있는 열린 접시를 UV 라이트 박스(Emulate Inc. 제공)에 넣습니다.
- UV 라이트 박스 뒷면에 있는 스위치를 "일관성" 설정으로 설정합니다. 전원을 켜고 UV 활성화를 시작합니다. 칩을 자외선 아래에 20분 동안 그대로 두십시오.
메모: 사람이 자외선에 노출되지 않도록 하십시오.
- 두 채널에서 ER-1 혼합물을 제거합니다.
- 각 채널을 200μL의 ER-2 용액으로 세척합니다.
- 두 채널 모두에서 ER-2를 제거합니다.
- 200μL의 멸균 저온 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 각 채널을 세척합니다.
- 다음 단계로 진행할 때까지 채널 내부에 콜드 DPBS를 그대로 두십시오.
- 세포외 기질(ECM) 준비 및 코팅
- 개별 ECM 구성 요소를 차가운 DPBS, 물 또는 기타 용매와 최종 작업 농도로 결합하여 ECM 용액을 준비합니다. ECM 용액은 사용할 때마다 신선하게 준비해야 합니다.
- 칩의 상단 및 하단 채널을 ECM으로 코팅하고, 시딩할 세포 유형에 따라 결정되는 조성을 사용합니다. ECM 혼합물은 사용할 때까지 얼음 위에서 유지해야 합니다.
- 라미닌(50μg/mL)을 사용하여 "뇌 쪽"을 코팅하고, 콜라겐 IV와 피브로넥틴을 4:1 비율(320:80μg/mL)로 혼합하여 섹션 5.6에 설명된 대로 "혈액 쪽"을 코팅합니다.
- ECM 부분 표본 준비
- 1mg/mL 라미닌을 차가운 DPBS에서 최종 농도 50μg/mL로 희석합니다. 분취제는 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- 콜라겐 IV를 0.1% 아세트산에 1mg/mL의 농도로 용해시킵니다. 용액을 2-8 °C에서 하룻밤 동안 또는 RT에서 1-3 시간 동안 또는 완전히 용해 될 때까지 배양하십시오.
- 콜라겐 IV:피브로넥틴 1mL 혼합물(콜라겐 IV 320μL, 피브로넥틴 80μL, 멸균 이중 증류 H2O 600μL)을 준비합니다. 혼합물은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
- ECM으로 칩 코팅
- 두 채널 모두에서 차가운 DPBS를 완전히 흡인합니다. P200 파이펫이 100μL의 콜라겐 IV:피브로넥틴 용액을 흡수하도록 설정합니다.
- 배출구에 작은 물방울이 형성될 때까지 하단 채널 입구를 통해 용액을 도입합니다. 피펫 팁을 제거한 후 주입구에 작은 물방울을 남겨둡니다.
- 배출구에 작은 방울이 형성될 때까지 상단 채널 입구를 통해 라미닌 용액을 주입합니다. 피펫 팁을 제거한 후 주입구에 작은 물방울을 남겨둡니다.
- 채널을 자세히 살펴보고 기포가 없는지 확인하십시오. 기포가 있는 경우 모든 기포가 제거될 때까지 적절한 ECM 용액으로 채널을 세척하십시오.
- 각 칩에 대해 5.5.1–5.5.4단계를 반복합니다.
- 1.5mL 원뿔형 튜브의 캡에 15mL의 DPBS를 추가합니다. 칩과 함께 150mm 배양 접시에 DPBS 캡을 놓고 추가 습도를 제공하고 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 최상의 결과를 얻으려면 칩을 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
메모: 원하는 경우 칩 활성화 및 ECM 코팅과 같은 날 세포를 파종할 수 있지만 하룻밤 배양이 선호됩니다. 칩은 ECM을 추가하고 37 ° C에서 칩을 배양 한 후 4 시간 동안 파종 할 준비가되었습니다.
6. "brain side" 채널을 시딩하고 EZ sphere를 혼합 신경 배양으로 분화하기
- 준비된 칩이 들어있는 접시를 BSC로 가져옵니다. 200μL의 NDM으로 두 채널을 부드럽게 세척합니다.
- 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 미디어 방울을 조심스럽게 흡인합니다. 균질한 세포 현탁액을 보장하기 위해 각 칩을 시딩하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 교반
합니다.
- iNPC를 상단 채널에 시딩하여 "브레인 사이드"를 생성합니다.
- 세포(1 x 106 cells/mL)를 칩의 상단 채널에 시드합니다. 30–100 μL의 세포 현탁액이 포함된 P200 팁을 상단 채널 주입구에 추가하고 파이펫에서 팁을 부드럽게 분리합니다. 빈 P200 피펫을 가져와서 플런저를 누르고 상단 채널 배출구에 삽입한 다음 칩을 통해 단일 셀 현탁액을 조심스럽게 당깁니다.
- 접시를 덮고 현미경으로 옮겨 상단 채널 내 세포의 파종 밀도와 균일한 분포를 확인합니다. 칩 입구와 출구 포트에서 파이펫 팁을 부드럽게 제거합니다.
- 파종 밀도는 20% 적용 범위로 나타나야 합니다. 파스딩 밀도가 예상보다 높거나 낮거나 고르지 않은 경우 칩을 BSC로 되돌리고 200μL의 새 배지로 채널을 2x로 세척한 다음 6.3.1단계를 반복합니다.
- 정확한 세포 밀도를 확인한 후 각 칩 배치를 파종한 후 즉시 칩을 37°C에서 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 새로운 NDM으로 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다.
- 흐름을 시작하기 전에 최소 48시간 동안 매일 NDM을 교체하여 37°C의 정적 조건에서 세포를 유지하십시오.iBMEC는 iNPC가 부착된 후 또는 iNPC 시딩 다음 날에 시딩할 수 있습니다.
7. iBMEC를 하단 채널에 시딩하여 "혈액 측" 생성
- 준비된 칩이 들어있는 접시를 BSC로 가져옵니다. 200μL의 EC 배지로 하단 채널을 부드럽게 세척합니다.
- 포트와의 접촉을 피하고 칩 표면에서 과도한 EC 매체의 방울을 조심스럽게 흡인하고 두 채널에 매체를 남겨 두십시오. 균질한 세포 현탁액을 보장하기 위해 각 칩을 시딩하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 교반합니다.
- P200 피펫을 사용하여 30–100 μL의 iBMEC 세포 현탁액(14–20 x 106 cells/mL)을 추출하고 팁을 하단 채널 주입구에 놓습니다. 피펫에서 팁을 부드럽게 분리하고 세포 포함 팁은 주입구에 남겨둡니다.
- 팁이 비어 있는 P200 피펫의 플런저를 누르고, 하단 채널 배출구에 삽입한 다음, 피펫 플런저를 천천히 해제하여 하단 채널을 통해 단일 셀 현탁액을 조심스럽게 당깁니다.
- 칩 표면에서 과도한 세포 현탁액을 흡인합니다. 세포 현탁액이 채널 밖으로 흡입되지 않도록 흡입구 및 배출구 포트와의 직접적인 접촉을 피하십시오.
- 칩을 덮고 현미경으로 옮겨 파종 밀도를 관찰합니다. 하단 채널은 현미경으로 4x 또는 10x로 관찰할 때 세포 사이에 관찰할 수 있는 틈이 없어야 합니다(그림 3).
- 시딩 밀도가 90% 커버리지 미만이거나 불균일하게 분포된 경우 그에 따라 셀 밀도를 조정하고 채널 내에서 올바른 밀도에 도달할 때까지 7.2–7.6단계를 반복합니다. 올바른 세포 밀도를 확인한 후(그림 3), 나머지 칩의 세포를 시드합니다. 하단 채널의 상단에 위치한 다공성 멤브레인에 세포를 부착하려면 각 칩을 반전시키고 칩 크래들에 놓습니다.
- 150mm 접시 내부에 작은 저장소(멸균 DPBS가 들어 있는 15mL 원추형 튜브 캡)를 놓아 세포에 습도를 제공합니다. 37°C에서 약 3시간 동안 또는 하단 채널의 세포가 부착될 때까지 칩을 배양합니다. iBMEC가 부착되면(시딩 후 ~3시간) 칩을 다시 수직 위치로 뒤집어 하단 채널의 하단 부분에 셀을 부착할 수 있도록 합니다.
8. 흐름의 시작
- 흐름은 일반적으로 iBMEC의 시딩 후 48시간 후에 시작됩니다. 이 시간은 iBMEC가 칩에 단단히 부착되는 데 필요합니다.
- 칩을 통한 층류를 유지하려면 매체의 온도를 탈기하고 평형을 이루는 것이 중요합니다. 매체는 37°C 수조에서 1시간 동안 예열해야 합니다.
- 최대 50mL의 가온 매체는 진공 구동 여과 시스템에서 15분 동안 배양하여 가스를 제거할 수 있습니다.
- 휴대용 모듈의 프라이밍
- 휴대용 모듈 포장 및 트레이의 외부를 70% 에탄올로 소독하고 닦은 다음 BSC로 옮깁니다. 패키지를 열고 모듈을 트레이에 넣습니다. 저장소가 트레이 뒤쪽으로 향하도록 방향을 잡습니다.
- 3mL의 사전 평형을 이룬 따뜻한 매체를 각 주입구 저장소에 피펫팅합니다. EC 배양 배지를 하단 채널의 Inlet Reservoir에 추가하고 NDM을 상단 채널의 상단 채널 Inlet Reservoir에 추가합니다(그림 4).
- 300μL의 사전 평형을 이룬 따뜻한 매체를 각 배출구 포트 바로 위의 각 배출구 저장소에 피펫팅합니다(그림 4).
- 각 트레이에 최대 6개의 휴대용 모듈을 놓습니다. 트레이를 인큐베이터로 가져오고 트레이 손잡이가 바깥쪽을 향하도록 하여 배양 모듈에 완전히 밀어 넣습니다.
- 배양 모듈에서 "Prime" 주기를 선택하고 실행합니다. 인큐베이터 도어를 닫고 배양 모듈이 휴대용 모듈을 프라이밍할 수 있도록 합니다(~1분 소요). 상태 표시줄에 "준비"가 표시되면 프라이밍 주기가 완료된 것입니다. 배양 모듈에서 트레이를 제거하고 BSC로 가져옵니다.
- BSC의 각 휴대용 모듈 밑면을 검사하여 휴대용 모듈이 성공적으로 프라이밍되었는지 확인합니다. 4개의 포트 모두에 작은 방울이 있는지 확인합니다.
- 휴대용 모듈에 드롭릿이 표시되지 않으면 해당 모듈에서 프라임 사이클을 다시 실행합니다. 트레이에 미디어가 떨어졌을 경우(배출 포트에서 더 자주 발생할 수 있음) 70% 에탄올로 트레이를 청소합니다.
- 휴대용 모듈에 칩의 연결, 조절 및 흐름의 시작
- 각 칩의 두 채널을 따뜻하고 평형을 이룬 세포 특이적 배양 배지로 부드럽게 세척하여 채널에서 가능한 기포를 제거하고 각 입구 및 출구 포트 상단에 작은 배지 방울(채널의 배지에 따라)을 놓습니다.
- 캐리어가 있는 칩을 휴대용 모듈에 삽입하고 각 트레이에 최대 6개까지 놓습니다. 배양 모듈에 트레이를 삽입합니다. 배양 모듈에서 적절한 장기 칩 배양 조건(유속 및 스트레치)을 프로그래밍합니다.
- 프로그래밍된 조건은 "조절" 주기가 완료되는 즉시 시작됩니다.
메모: 각 채널의 유속은 독립적으로 제어할 수 있으며 0–1,000μL/h 범위의 속도로 설정할 수 있습니다. BBB 칩은 일반적으로 30μL/h에서 배양됩니다. 30 μL/h 및 1000 μL/h에서 EC 매체 또는 ESM과 같은 유체 매체에서 전단력은 각각 0.01 dyn/cm2 및 0.33 dyn/cm2입니다.
- 약 2시간이 소요되는 "조절" 주기를 실행한 후 배양 모듈은 사전 설정된 장기 칩 배양 조건에서 흐름을 시작합니다.
