Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons(쥐 배아에서 세포 분리 및 배양)

초록

출처: Landeira, B. S., et al. 2D 배양 시스템을 사용한 일차 대뇌 피질 세포의 라이브 이미징. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 마우스 배아의 배측 뇌파에서 1차 대뇌 피질 세포를 분리하고 배양하는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 배외측 Telencephalon Microdissection

1. 해부 배지 준비(100mL): 98.5mL 행크스 밸런스 염 용액(HBSS), 0.5mL 5M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) pH 7.4, 1mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL).
2. 해부 매체를 필터 살균합니다.
3. 임신한 마우스 C57/Bl6(Mus musculus)에서 이소플루란으로 마취한 배아 14일(E14) 배아를 제거합니다.
   메모: E0를 질 마개 감지의 날로 간주하십시오. 해부는 임신한 쥐에서 제거한 후 1시간 이내에 완료해야 합니다. 이 프로토콜은 배아 E11-E17에도 적용됩니다.
4. 무균 상태에서 자궁절제술로 배아를 제거합니다.
5. 배아를 냉 해부 매체(4 °C)가 있는 페트리 접시로 옮깁니다.
6. 세로 균열을 따라 절단하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 배아의 수는 보통 5개에서 10개까지 다양하다. 각 E14 뇌는 전구 세포와 유사 분열 후 뉴런을 포함하여 약 2 x 10⁶ 개의 세포를 생성합니다 (1 : 1 비율)
   메모: 다음 단계를 위해 실체현미경을 사용합니다.
7. 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 반구를 분리하기 위해 중간에 텔렌스팔론을 분할합니다. 배외측 텔뇌팔론을 분리하려면 해부 겸자를 사용하여 배측 곡선과 구골-팔하경계 경계를 따라 자릅니다. 모든 뇌가 절개될 때까지 배외측 텔렌스팔론을 냉박부 배지(4°C)가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다.

2. 세포 해리 및 도금

1. 증식 배지 준비(DMEM+10% FCS 50mL): 44mL Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM), 5mL 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 증식 매체를 필터 살균합니다.
2. 분화 배지 준비(DMEM 50mL + 2% B27): 48mL DMEM, 1mL B27, 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 분화 매체를 필터 멸균합니다.
3. E14 마우스에서 배외측 텔렌스팔론을 미세 해부한 후, 수집된 조직과 냉 해부 배지가 있는 튜브를 원심분리하여(4°C에서 5분, 340 x g) 조직을 침전시킵니다.
4. 피펫으로 상층액을 제거하고 화학적 분해를 위해 예열된(37°C) 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL(0.05%)를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.트립신 활성을 중지하기 위해 2mL의 증식 배지를 추가합니다.
5. 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 가스 버너 또는 분젠 버너에 몇 초 동안 연마하여 조리개를 약간 좁힙니다. 팁을 코팅하기 위해 FCS를 흡인하여 피펫을 세척합니다. 기포를 피하려면 화염 연마 및 FCS 코팅된 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 분리하십시오.
6. 세포를 원심분리합니다(4°C, 340 x g에서 5분 동안). 피펫으로 상층액을 제거합니다. 1mL의 증식 배지를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
7. 0.4% Trypan Blue 용액을 사용하여 세포 현탁액을 1:1 희석합니다. 생존할 수 없는 세포는 파란색이 됩니다. Neubauer 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포(염색되지 않음)의 수를 계산합니다.
8. 증식 배지에서 세포를 희석하여 10⁶ cells/mL를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가합니다(약 2.5 ×^{10 5} cells/cm²). 37 °C 및 5 % CO².
   에서 세포를 배양합니다. 메모: 유리 커버 슬립은 실험 중에 움직이고 관찰 영역을 변경할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 또는 유리 바닥 조직 배양 플레이트를 사용합니다.
   메모: 세포 배양 처리된 멀티디쉬를 사용하지 않는 경우 37°C에서 2시간 동안 Poly-D-Lysin(50μg/ml)으로 플레이트를 전처리하는 것이 중요합니다. PDL 처리된 플레이트는 증류수로 세척한 후 4°C에서 보관할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	Invitrogen 생명 기술	14175129
헤페스	시그마-알드리치	H3375-25G
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140122
Dulbecco 수정 독수리 매체 (DMEM)	지브코	제12400-024
송아지 태아 혈청(FCS)	지브코	10437028
포도당	지브코	A2494001
나27	지브코	17504044
트립신-EDTA (0.05%)	지브코	25300054
세포 관찰자 현미경	자이스

호