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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 배외측 Telencephalon Microdissection
- 해부 배지 준비(100mL): 98.5mL 행크스 밸런스 염 용액(HBSS), 0.5mL 5M 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) pH 7.4, 1mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL).
- 해부 매체를 필터 살균합니다.
- 임신한 마우스 C57/Bl6(Mus musculus)에서 이소플루란으로 마취한 배아 14일(E14) 배아를 제거합니다.
메모: E0를 질 마개 감지의 날로 간주하십시오. 해부는 임신한 쥐에서 제거한 후 1시간 이내에 완료해야 합니다. 이 프로토콜은 배아 E11-E17에도 적용됩니다.
- 무균 상태에서 자궁절제술로 배아를 제거합니다.
- 배아를 냉 해부 매체(4 °C)가 있는 페트리 접시로 옮깁니다.
- 세로 균열을 따라 절단하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 배아의 수는 보통 5개에서 10개까지 다양하다. 각 E14 뇌는 전구 세포와 유사 분열 후 뉴런을 포함하여 약 2 x 106 개의 세포를 생성합니다 (1 : 1 비율)
메모: 다음 단계를 위해 실체현미경을 사용합니다.
- 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 반구를 분리하기 위해 중간에 텔렌스팔론을 분할합니다. 배외측 텔뇌팔론을 분리하려면 해부 겸자를 사용하여 배측 곡선과 구골-팔하경계 경계를 따라 자릅니다. 모든 뇌가 절개될 때까지 배외측 텔렌스팔론을 냉박부 배지(4°C)가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다.
2. 세포 해리 및 도금
- 증식 배지 준비(DMEM+10% FCS 50mL): 44mL Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM), 5mL 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 증식 매체를 필터 살균합니다.
- 분화 배지 준비(DMEM 50mL + 2% B27): 48mL DMEM, 1mL B27, 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 분화 매체를 필터 멸균합니다.
- E14 마우스에서 배외측 텔렌스팔론을 미세 해부한 후, 수집된 조직과 냉 해부 배지가 있는 튜브를 원심분리하여(4°C에서 5분, 340 x g) 조직을 침전시킵니다.
- 피펫으로 상층액을 제거하고 화학적 분해를 위해 예열된(37°C) 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL(0.05%)를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.트립신 활성을 중지하기 위해 2mL의 증식 배지를 추가합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 가스 버너 또는 분젠 버너에 몇 초 동안 연마하여 조리개를 약간 좁힙니다. 팁을 코팅하기 위해 FCS를 흡인하여 피펫을 세척합니다. 기포를 피하려면 화염 연마 및 FCS 코팅된 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 분리하십시오.
- 세포를 원심분리합니다(4°C, 340 x g에서 5분 동안). 피펫으로 상층액을 제거합니다. 1mL의 증식 배지를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 0.4% Trypan Blue 용액을 사용하여 세포 현탁액을 1:1 희석합니다. 생존할 수 없는 세포는 파란색이 됩니다. Neubauer 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포(염색되지 않음)의 수를 계산합니다.
- 증식 배지에서 세포를 희석하여 106 cells/mL를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가합니다(약 2.5 ×10 5 cells/cm2). 37 °C 및 5 % CO2.
에서 세포를 배양합니다.
메모: 유리 커버 슬립은 실험 중에 움직이고 관찰 영역을 변경할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 또는 유리 바닥 조직 배양 플레이트를 사용합니다.
메모: 세포 배양 처리된 멀티디쉬를 사용하지 않는 경우 37°C에서 2시간 동안 Poly-D-Lysin(50μg/ml)으로 플레이트를 전처리하는 것이 중요합니다. PDL 처리된 플레이트는 증류수로 세척한 후 4°C에서 보관할 수 있습니다.