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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
참고: 세포 배양 용액은 생물 안전 캐비닛에서 멸균 절차를 사용하여 준비하고 오염을 방지하기 위해 0.2μm에서 여과해야 합니다.
1. 용액 및 배양 배지의 준비
- 20μL의 1mg/mL 라미닌 스톡을 멸균 증류된 H2O 2mL에 희석하여 라미닌 코팅 용액을 준비합니다. 해부 당일에 준비합니다.
- 1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 45mL에 ES 5mL를 첨가하여 10% 말(말) 혈청(ES) 정지 용액을 준비합니다. 0.2μm 필터 시스템 또는 주사기 필터 팁을 사용하는 멸균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 BSA 분말 2g을 첨가하고 최종 부피 45mL가 되도록 하여 4% 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 준비합니다. 0.2μm 필터 시스템 또는 주사기 필터 팁을 사용하는 멸균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
- 파파인을 1x HBSS에서 3mg/mL로 희석하여 파파인 스톡 용액을 준비합니다. 0.2μm 필터 시스템 또는 주사기 필터 팁을 사용하는 멸균 필터. -20 °C에서 보관하십시오.
- 멸균H2O에 DNase 분말 20mg을 첨가하고 최종 부피 20mL가 되도록 하여 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 용액을 준비합니다. 0.2μm 필터 시스템 또는 주사기 필터 팁을 사용하는 멸균 필터. -20 °C에서 보관하십시오.
- 멸균 증류된 H2O에 352mg의 아스코르브산을 첨가하고 최종 부피 20mL로 가져와 아스코르브산 원액을 준비합니다. 필요한 경우 37°C 욕조에서 가열하여 녹입니다. 0.2μm 필터 시스템 또는 주사기 필터 팁을 사용하는 멸균 필터. -20 °C에서 보관하십시오.
- Neurobasal 배지 50mL에 글루타맥스(100x) 500μL, 말 혈청 500μL, B-27 1mL, 아스코르브산 100μL, 페니실린-스트렙토마이신 500μL, 카나마이신 50μL 및 암피실린 50μL를 첨가하여 세포 배양 배지를 준비합니다. 0.2μm 필터 시스템을 사용하는 멸균 필터. 4 °C에서 보관하십시오.
10% 용액을 만들기 위해 - 1x PBS 9mL에 Triton X-100 1mL를 첨가하여 0.01% Triton X-100 용액을 준비합니다. Triton X-100은 점성이 있으므로 팁이 완전히 채워질 수 있도록 천천히 피펫을 주입합니다. 필요한 경우 37°C 수조에서 가열하여 녹입니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- Triton X-100 스톡을 10%로 0.01%로 희석하려면 1:10 직렬 희석을 3회 수행합니다. 10% 스톡 1mL를 1x PBS 9mL에 희석하여 1% 용액을 만듭니다. 1% 용액 1mL를 1x PBS 9mL에 희석하여 0.1% 용액을 만듭니다. 0.1% 용액 1mL를 1x PBS 9mL에 희석하여 0.01% 용액을 만듭니다.
- 10% 용액의 경우 1x PBS 9mL에 NGS 1mL를 첨가하고 1x PBS 9.9mL에 NGS 100μL를 추가하여 1% 용액을 만들어 10% 및 1% 정상 염소 혈청(NGS) 용액을 준비합니다.
- 멸균 증류된 H2O에 735mg의 L(+)-글루탐산을 첨가하고 최종 부피 50mL가 되도록 하여 글루타메이트 원액(100mM)을 준비합니다. 이 농도에서의 용해도가 문제가 될 것입니다. 1M 염산의 소량(100μL)을 추가하면 용해도를 높이기에 충분합니다.
- 멸균 증류된 H2O에 NBQX 50mg을 첨가하고 최종 부피 13mL로 만들어 NBQX 스톡 용액(10mM)을 준비합니다.
2. 배양 접시 및 커버 슬립 준비 (해부 전날 완료)
참고: 우리는 폴리-L-라이신, 폴리-L-오르니틴 및 라미닌의 세 가지 코팅제를 결합하면 이상적인 세포 접착력과 생존력을 얻을 수 있음을 발견했습니다.
- 생물 안전 캐비닛에 10개의 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 각 접시에 두 개의 원형 12mm 커버슬립을 놓고 10분 동안 70% EtOH를 채웁니다. 진공 라인을 사용하여 각 접시에 남아 있는 EtOH를 흡인하여 EtOH가 완전히 증발하도록 합니다.
- 각 커버슬립에 ~90-100 μL의 0.1% 폴리-L-라이신 용액을 피펫팅하여 전체 커버슬립이 덮여 있는지 확인합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
- 각 커버슬립에서 남은 폴리-L-라이신 용액을 흡입하고 멸균 H2O로 헹굽니다.
- 0.1% 폴리-L-오르니틴 용액으로 2.2-2.3단계를 반복합니다.
- 다시 2.2% 라미닌 용액으로 2.3 – 0.01단계를 반복합니다. 다음 날 세포 도금이 준비될 때까지 37°C/5% CO2 인큐베이터에 넣습니다.
3. 쥐 배아 해부
참고: 우리는 배양당 4-6마리의 임신 마우스를 사용합니다. 해부 과정의 대부분은 생물 안전 캐비닛 밖에서 발생하지만 멸균 절차를 유지하는 것은 여전히 중요합니다. 해부 현미경 근처의 표면과 수술 도구에 70% EtOH를 충분히 사용하는 것이 이상적입니다. 오염을 더욱 방지하기 위해 해부 중에 마스크를 착용할 수도 있습니다. 또한 배양 배지에 4개의 개별 항생제를 사용하므로 오염 가능성이 낮습니다. 그러나 항생제 사용에 문제가 있는 경우 이 해부 설정을 멸균 후드 내부로 옮길 수 있습니다. 세포 생존력을 보존하기 위해 모든 박리 용액은 4°C에서 사전 냉각되어야 하며 가능한 한 빨리 해부를 완료해야 합니다. 얼음 위에서 해부는 하지 않습니다. 쥐의 배아 중뇌 뉴런을 해부하는 방법은 앞서 설명한 방법과 동일하다.
- 흡수 패드가 있는 해부 현미경 근처의 벤치에 공간을 마련하고 70% EtOH를 넉넉히 분사합니다.
- 100 x 15mm 유리 페트리 접시 2개와 50 x 10mm 유리 페트리 접시 1개에 70% EtOH를 분사하고 EtOH가 증발하도록 합니다. 증발이 완료되면 멸균 1x HBSS 50mL를 각 100 x 15mm 페트리 접시에 넣습니다.
- 수술용 가위, 집게 및 마이크로톰 블레이드를 70% EtOH에 최소 10분 동안 담가 살균합니다. 기구를 흡수 패드에 올려 말리십시오.
- CO2 후 자궁 경부 탈구를 사용하여 배아 14일에 2-3개월 된 시간 지정 임신 마우스를 안락사시킵니다.
- 안락사된 쥐의 복부에 EtOH 70%를 살포합니다. 겸자를 사용하여 하복부를 잡고 수술 용 가위를 사용하여 복강을 엽니 다. 겸자가 복부를 잡고 있는 곳 근처에서 절단을 시작하여 복벽을 뒤로 접을 수 있고 자궁이 명확하게 보일 때까지 양쪽을 옆으로 자릅니다.
- 수술용 가위를 사용하여 자궁 뿔의 양쪽 끝을 자릅니다. 그런 다음 자궁을 제거하고 1x HBSS가 있는 페트리 접시에 넣습니다.
- 끝이 곧은 집게를 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 이 과정에서 배아를 HBSS에 남겨둡니다. 집게나 마이크로톰 칼날을 사용하여 목 근처를 잘라 배아의 목을 빠르게 잘라냅니다. 가능한 한 수평으로 자르십시오.
- 해부 현미경으로 배아 머리를 건조한 50mm 페트리 접시로 옮기고 복부 쪽에 놓습니다. 눈/주둥이 근처에 놓고 관통하여 집게로 머리를 안정시킵니다. 겸자는 중뇌를 관통하지 않도록 ~45°로 아래쪽으로 기울어져야 합니다.
- 반면에 집게를 사용하여 중뇌의 두드러진 융기 직전에 피부와 두개골의 반투명 층을 조심스럽게 제거합니다. 정중선 근처에서 시작하여 중뇌가 완전히 노출될 때까지 피부와 두개골을 꼬리 쪽으로 제거합니다.
- 겸자를 노출된 중뇌에 수직으로 잡고 한쪽 끝은 피질과 중뇌 사이에, 다른 쪽 끝은 소뇌 근처에 놓습니다. 겸자를 아래로 누르고 꼬집어 전체 중뇌를 제거합니다. 중뇌 분절의 두께는 약 0.5mm여야 합니다. 중뇌 분절을 신선한 1x HBSS로 채워진 두 번째 페트리 접시에 놓습니다. 각 배아에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 복부 쪽이 위를 향하도록 뇌 분절을 배치합니다. 수막이 여전히 붙어 있으면 집게로 잡고 들어 올려 뇌 분절에서 분리하여 조심스럽게 제거하십시오.
- 뇌 분절에는 4개의 보이는 사분면이 있어야 합니다. 두 개의 작은 사분면이 두 개의 큰 사분면보다 상위에 배치되는 방식으로 세그먼트를 배치합니다. 상위 2개(작은) 사분면과 하위 2개(큰) 사분면을 분리하는 눈에 띄는 능선이 있습니다.
- 겸자를 사용하여 상위 사분면과 하위 사분면을 집어 분리한 다음 상위 사분면을 버립니다. 나머지 하사분면은 등쪽 측면에 과도한 조직이 있으며, 이 조직은 나머지 복부 조직보다 덜 불투명하게 보입니다. 밀도가 낮은 등쪽 조직을 제거하고 버립니다. 나머지 분절에는 Substantia nigra pars compacta(SNc)와 복부 피개 영역(VTA)이 모두 포함되어야 합니다.
- 겸자를 사용하여 나머지 복부 조직 분절을 4개의 작은 조각으로 자르고 1mL 너비의 내경 피펫을 사용하여 이 분절을 1x HBSS가 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 시술 내내 뇌 분절이 있는 원뿔형 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 나머지 모든 뇌 분절에 대해 이 과정을 반복합니다.
4. 세포의 해리
- 세포의 효소 분해
- 중뇌 분절이 포함된 15mL 원뿔형 튜브에서 HBSS를 조심스럽게 흡인하고 분절은 튜브 바닥에 남겨둡니다.
- 튜브에 ~800μL의 파파인 용액을 넣고 37°C 인큐베이터에 7분 동안 넣습니다. 튜브를 튕겨 세포를 재현탁시키고 추가로 7분 동안 37°C 인큐베이터로 교체합니다.
- 넓은 구멍의 1 mL 피펫 팁을 사용하여 중뇌 분절만 1 mL의 DNase 분취액으로 제거합니다. 분절이 부분 표본의 바닥에 도달하거나 약 1분 동안 노출되도록 합니다.
- 넓은 구경의 1 mL 피펫 팁을 사용하여 2 mL의 정지 용액이 들어있는 15 mL 원뿔형 튜브로 중뇌 세그먼트만 제거합니다. 세그먼트가 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 정지 용액으로 채워진 추가 원뿔형 튜브에서 헹굼을 반복합니다.
- 세포 현탁액의 기계적 분쇄
- 두 번째 중지에서는 용액 헹굼 튜브에서 넓은 구경의 1mL 피펫 팁을 사용하여 큰 조직 분절이 보이지 않을 때까지 세포를 위아래로 10회 피펫팅합니다. 세포 용해를 최소화하기 위해 과도한 적정을 피하는 것이 중요합니다.
- 300μL의 4% BSA 용액을 뇌 분절이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브의 바닥에 천천히 피펫팅합니다. 현탁액 층을 유지하기 위해 피펫 팁을 조심스럽게 제거합니다. 0.4 x g에서 3분 동안 원심분리기 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡인하고 400μL의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
5. 세포 도금
참고: 경험에 비추어 볼 때, 배아 당 약 100,000개의 생존 가능한 세포가 수집됩니다. 2-3개월 된 시간 지정 임신 마우스는 일반적으로 8-10개의 배아 크기를 가지고 있습니다; 따라서, 시간 지정 임신 마우스 당 세포의 총 수율에 대한 대략적인 추정치는 약 100만 개의 세포입니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행한 다음 세포 배양 배지를 사용하여 현탁액을 2,000 cells/μL로 희석합니다. 간단히 섞습니다.
- 인큐베이터에서 2단계의 라미닌 용액이 포함된 커버슬립을 제거하고 진공 청소기를 사용하여 코팅된 커버슬립에서 나머지 라미닌 용액을 흡입합니다. 커버 슬립이 완전히 건조되는 것을 방지하기 위해 빠르게 플레이트하십시오. 각 커버슬립에 100μL(2.0 x 105셀/커버슬립)를 피펫팅하고 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
- 각 접시에 3mL의 세포 배양 배지를 조심스럽게 추가하고 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 2주 동안 매주 2회씩 반중간 정도의 변화를 줍니다.
6. 14 DIV에서 세포 배양에서 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터로 감염
- 각 요리에 대해 1μL의 hSyn-GCaMP6f AAV(1.0 x 1013 역가)가 포함된 무혈청 DMEM 배지 1mL를 준비합니다.
- 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고 hSyn-GCaMP6f를 함유한 1mL의 무혈청 DMEM으로 교체합니다. 그런 다음 접시를 37°C 인큐베이터에 다시 1시간 동안 넣습니다.
- AAV를 함유한 무혈청 배지를 흡입하고 3mL의 세포 배양 배지로 교체합니다. 접시를 37 ° C 인큐베이터에 다시 놓습니다. 우리는 AAV 감염 5-7일이 이상적인 수준의 GCaMP 발현을 허용한다는 것을 발견했습니다. 이 바이러스 감염 기간 동안 2-3일마다 배지를 계속 교체하십시오.
7. 19-21 DIV 사이의 라이브 컨포칼 Ca2+ 이미징
- 레코딩 버퍼 준비
- 1 L의 HEPES 기록 버퍼를 만들려면 NaCl 9.009g, KCl 0.3728g, D-포도당 0.901g, HEPES 2.381g, 1M CaCl2 원액 2 mL 및 1 M MgCl2 원액 500 μL를 멸균 증류 H2O 800 mL에 첨가합니다. NaOH로 pH를 7.4로 가져옵니다. 1L의 최종 부피로 가져옵니다.
- 200mL의 20μM 글루타메이트 기록 버퍼를 만들려면 40μL의 100mM 글루타메이트 원액을 위에서 설명한 200mL의 HEPES 기록 버퍼로 희석합니다.
- 200mL의 10μM NBQX 기록 버퍼를 만들려면 200μL의 10mM NBQX 원액을 200mL의 HEPES 기록 완충액으로 희석합니다.
- 컨포칼 이미징
- 멸균 35mm 페트리 접시에 3mL의 기록 버퍼를 채웁니다.
- 37°C 인큐베이터에서 감염된 배양액이 있는 35mm 페트리 접시를 제거합니다. 가는 끝 집게를 사용하여 하나의 커버슬립 가장자리를 조심스럽게 잡고 기록 버퍼로 채워진 페트리 접시에 빠르게 옮깁니다. 매체에 남아 있는 커버슬립을 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 기록 버퍼가 있는 접시를 컨포칼 현미경으로 운반합니다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화되는 동안 다음 단계를 진행합니다.
- 연동 펌프를 시작하고 라인을 기록 버퍼에 넣습니다. 유속을 2mL/분으로 보정합니다.
- 감염된 커버슬립을 35mm 페트리 접시에서 기록 수조로 옮깁니다.
- 10x Water Immersion Objective와 BF light를 사용하여 초점면을 찾고 뉴런 세포체의 밀도가 높은 영역을 찾습니다. 40x 침수 대물렌즈로 전환하고 BF 광을 사용하여 샘플의 초점을 다시 맞춥니다.
- FluoView의 "염료 목록" 창에서 AlexaFluor 488을 선택하여 적용합니다.
- AAV 발현은 가변적일 수 있으므로 형광단의 과다 노출 및 광표백을 방지하려면 낮은 HV 및 레이저 출력 설정으로 시작하십시오. AlexaFluor 488 채널의 경우 고전압(HV)을 500으로, 게인을 1x로, 오프셋을 0으로 설정합니다. 488 레이저 라인의 경우 강도를 5%로 설정합니다. z-평면에서 이미징된 유효 부피를 늘리려면 핀홀 크기를 300μm로 늘립니다. "focus x2" 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 저포화 수준으로 최적으로 조정할 수 있습니다. 여기에서 각 채널의 이상적인 가시성에 도달할 때까지 설정을 조정할 수 있습니다.
메모: GCaMP로 전체 범위의 Ca2+ 플럭스를 정확하게 캡처하려면 검출기를 과포화시키지 않고 형광 강도를 증가시킬 수 있도록 기준선 HV 및 레이저 출력 설정을 조정하십시오.
- 현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 나타내는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 초점을 맞춥니다.
- "Clip rect" 도구를 사용하여 이미징 프레임을 1초 미만의 프레임 간격을 달성할 수 있는 크기로 클립합니다. 이는 이미징 간격을 초당 1프레임으로 설정하는 데 필요합니다.
- "Interval" 창을 1.0 값으로 설정하고 "Num" 창을 600으로 설정합니다.
메모: 원하는 시점(300초)에 다른 기록 버퍼를 전달하려면 펌프의 대기 시간을 보정하여 새로운 솔루션을 수조에 전달하는 것이 중요합니다. 이는 용액 관류 속도(2mL/분)와 용액을 펌핑하는 데 사용되는 라인의 길이에 따라 달라집니다.
- T 시리즈 동영상을 캡처하려면 "시간" 옵션을 선택한 다음 "XYt" 스캐닝 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다.
- 이미징 진행률 표시줄을 관찰하고 적절한 시점에 HEPES 기록 버퍼에서 20μM 글루타메이트 기록 버퍼로 라인을 이동합니다(예: 펌프의 대기 시간이 60초에 용액을 전달하도록 보정된 경우 300초에 글루타메이트를 전달하기 위해 240프레임에서 라인을 글루타메이트 버퍼로 이동).
- 이미징이 완료되면 시리즈 완료 버튼을 선택하고 완성된 T-시리즈 동영상을 저장합니다. 추가로 5분 동안 20μM 글루타메이트를 계속 관류하여 배양된 뉴런이 총 10분 동안 글루타메이트에 노출되도록 합니다. 이미징할 각 커버슬립에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
- 20μM 글루타메이트에 5분 더 노출된 후 수조에서 커버슬립을 제거하고 이미징 당일까지 기록 버퍼가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 다시 넣습니다.