쥐 새끼 뇌에서 rhinal cortex-hippocampus 슬라이스 준비

초록

출처: Valente, C. A., et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오는 새끼 쥐의 뇌에서 rhinal cortex-hippocampus slice를 얻어 추가 분석을 위해 배지로 채워진 다중 웰 플레이트 내의 막질 삽입물로 배양하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. rhinal cortex-hippocampus slices의 준비

참고: rhinal cortex-hippocampus slices의 준비는 P6-7 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다.

1. 배양 설정 및 배지 준비
   1. 배양 전날에 필요한 배지를 준비하고 4°C에 놓습니다.
   2. 해부 매체 준비: Gey's Balanced Salt Solution(GBSS)에서 25mM 포도당.
   3. 배양 배지 준비: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% 말 혈청(HS), 25mM 포도당, 30μg/mL 겐타마이신.
   4. 유지 관리 매체 준비: Neurobasal-A(NBA), 2% B27, 1mM L-글루타민, 30μg/mL 겐타마이신, HS(15%, 10%, 5% 및 0%).
2. 두뇌 수확
   1. 배양을 시작하기 직전에 P1000 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에 1.1mL의 배양 배지를 추가하고 37°C에 놓습니다.
   2. 모든 장비(해부 현미경, 조직 다지기, 해부 램프, 해부 도구, 전극, 플레이트, 인서트 및 여과지)를 생물 안전 캐비닛 내부에 놓고 자외선 아래에서 15분 동안 살균합니다.
   3. 슬라이스 두께를 350μm로 조정합니다.
   4. 냉장고에서 GBSS를 꺼냅니다. 6개의 페트리 접시에 GBSS 5mL를 추가합니다. 동물당 6개의 페트리 접시가 필요합니다.
   5. 새끼 쥐를 안락사시킨다. 동물의 뇌간 기저부에 날카로운 가위를 사용하여 참수를 수행합니다.
   6. 동물의 머리를 차가운 GBSS로 세 번 씻고 안전 캐비닛 안으로 넣으십시오.
3. 조직 분리 및 절편 준비
   1. 날카로운 집게를 눈구멍에 단단히 삽입하여 머리를 고정합니다.
   2. 얇은 가위를 사용하여 척추공에서 시작하여 전두엽을 향해 정중선을 따라 피부/두피를 자르고 옆에 둡니다.
   3. 두개골과 같은 방식으로 대뇌 횡단 열구(뇌와 소뇌 사이의 공간)를 따라 자릅니다. 구부러진 긴 집게로 멀리 움직입니다.
   4. 후각구는 주걱으로 버립니다. 머리에서 뇌를 제거하고 등쪽 표면이 위를 향하도록 얼음처럼 차가운 GBSS에 놓습니다(그림 1A).
   5. 가는 집게를 소뇌에 삽입하고 주걱으로 각 반구를 매우 조심스럽게 벌리면서 정중선을 따라 이동합니다(그림 1B).
   6. 짧은 곡선 겸자로 해마 구조를 건드리지 않고 해마를 덮고 있는 여분의 조직을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 주걱으로 각 해마 아래를 자릅니다(그림 1C).
   7. 한쪽 반구를 집어 해마가 위를 향하도록 여과지 위에 놓습니다. 다른 반구에 대해 절차를 반복하고 여과지에 첫 번째 반구와 평행하게 놓습니다. 반구가 블레이드에 수직이 되도록 티슈 초퍼에 여과지를 놓고 반구를 350μm 조각으로 자릅니다(그림 1D).
   8. 얇게 썬 조직을 차가운 GBSS와 함께 페트리 접시에 넣습니다(그림 1E).
   9. 둥근 팁 전극을 사용하여 슬라이스를 조심스럽게 분리합니다(그림 1F). 구조적으로 손상되지 않은 비강 피질과 해마가 있는 조각만 보관하십시오. DG 및 CA 영역뿐만 아니라 내후각 및 주위 피질도 완벽하게 정의되어야 합니다(그림 1G).
   10. 각 슬라이스를 주걱과 둥근 팁 전극을 사용하여 인서트(그림 1H-I)에 놓습니다. P20 피펫으로 각 슬라이스 주위의 여분의 절개 매체를 제거합니다(그림 1J). 4개의 rhinal cortex-hippocampus 절편을 단일 삽입체로 배양할 수 있습니다(그림 1K).
4. 문화 유지 관리
   1. 격일로 매체를 변경합니다.
   2. 배지를 37°C에서 예열합니다.
   3. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 집게로 플라스틱 가장자리를 잡고 각 삽입물을 들어 올립니다(그림 1L).
   4. 자유로운 손을 사용하여 우물에서 매체를 흡인합니다. 인서트를 웰에 다시 넣고 P1000 피펫과 함께 새로 데워진 배지 1mL를 추가합니다(그림 1M). 모든 삽입에 대해 반복합니다. 멤브레인과 매체 사이에 기포가 끼이지 않도록 하십시오.

결과

그림 1: rhinal cortex-hippocampus organotypic slice 준비를 위한 세부 절차. (A) 머리에서 뇌를 제거하고 등쪽 표면이 위를 향하도록 얼음처럼 차가운 GBSS에 놓습니다. (B) 집게를 소뇌에 삽입합니다. 정중선을 통해 뇌를 열고 해마 위의 과도한 조직을 제거합니다. (C) 화살표로 표시된 대로 해마 아래를 자른 주걱으로. (D) 양쪽 해마를 위로 향하게 놓고 서로 평행하게 여과지에 놓고 조직 초퍼에서 350μm 슬라이스를 자릅니다. (E) 얇게 썬 해마를 얼음처럼 차가운 GBSS에 넣습니다. (F) 둥...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메스 손잡이용 블레이드	정밀 과학 도구	10011-00
뇌/조직 슬라이스 챔버 시스템	워너 인스트루먼트
세포 배양 인서트, 30mm, 친수성 PTFE	밀리포어 SAS	PICM03050
기존 인큐베이터	Thermo Scientific 헤레우스	BB15, 기능 라인	37°C 및 5% CO2로 설정
D(+)-포도당 일수화물	머크 밀리포어	1.08342.1000
D-(+)-포도당 용액, 물 45%	시그마	G8769 (영문
디소듐 수소 인산염 이수화물	머크 밀리포어	1.06580.1000
Dumont #5 파인 펜치 바이오로지 이녹스	정밀 과학 도구	11254-20
Dumont #5 집게 스탠다드 이녹스	정밀 과학 도구	11251-20
Dumont # 7 집게 스탠다드 Dumoxel	정밀 과학 도구	11271-30
Dumont 메디컬 #7S 펜치 쇼트 커브 이녹스	정밀 과학 도구	11273-22
겐타마이신 원액, 50 mg/mL	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15750-037
Gey의 균형 잡힌 소금 용액 (GBSS)	생물 산업	01-919-1ᄀ
유리 전극	과학 제품	GB150F-10	수제 라운드 팁
유리 파스퇴르 피펫, 230 mm	VWR 국제공항	612-1702
호스 세럼, 열 비활성화 (HS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제26050-088
아이리스 스패튤라 커브드	정밀 과학 도구	10092-12
Labculture 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛	헤라스사페	고등학교 12
L-글루타민 용액 200mM(Q)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제25030-024
Neurobasal-A 미디엄 (NBA)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10888-022
Opti-MEM® I 리듀스-세럼 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985-047
플래티넘 5 블레이드	질 레트
품질 여과지, 셀룰로오스, 1등급, 55mm	왓맨	1001-055	중간 유지율 11μm
품질 여과지, 셀룰로오스, 1등급, 90mm	왓맨	제1001-090	중간 유지율 11μm
메스 손잡이	정밀 과학 도구	91003-12
TC 처리된 멸균 6웰 플레이트	코 닝	CORN3516
온도 조절기	의료 시스템 공사	TC-102
티슈 헬기	미클 연구소 엔지니어링 CO., LTD.	선교사 훈련원/2	350μm로 설정

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