감각 뉴런 분리 및 자연 살해 세포와의 공동 배양

초록

출처:Ahmadi, A., et al. 자연 살해 세포와 통각 수용기 뉴런 사이의 상호 작용을 놀리고 있습니다. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 효소 분해, 기계적 분해 및 구배 원심분리를 통한 DRG 뉴런의 분리에 대해 설명합니다. DRG 세포는 면역 세포와 감각 뉴런 간의 상호 작용을 연구하기 위해 세포 외 기질에서 자연 살해 세포와 공동 배양됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. NK 세포 분리, 배양 및 자극

1. 통각(유해) 수용기 뉴런을 그대로 생성(littermate control; lox-stop-lox-diphtheria 독소 마우스(DTAfl/fl)와 TRPV1cre/wt 마우스를 교배하여 TRPV1wt::D TAfl/wt) 및 절제(TRPV1cre::D TAfl/wt) 마우스를 사용합니다.
2. CO2 흡입을 사용하여 나이브 리터메이트 대조군(TRPV1wt::D TAfl/wt) 마우스를 안락사시킵니다.
3. 500μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 비장을 수집합니다.
4. 유봉을 사용하여 비장을 균질화합니다.
5. 1mL의 멸균 PBS로 세포를 희석합니다.
6. 50μm 세포 여과기를 통해 혼합물을 15mL 원뿔형 튜브로 여과합니다.
7. 멸균 PBS로 용량(10mL)을 채웁니다.
8. 10μL를 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
9. 세포를 원심분리(500×g, 5분)하고 상층액을 제거합니다.
10. 보충된 RPMI 1640 배지에서 10⁸ cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다.
11. 제조업체의 지침에 따라 마우스 NK 세포 분리 키트를 사용하여 비장 자연 살해(NK) 세포를 자기 정제합니다. 유세포분석을 사용하여 NK 세포 순도를 확인합니다.
12. 10μL를 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
13. 세포를 원심분리(500×g, 5분)하고 상층액을 제거합니다.
14. 보충된 RPMI 1640 배양 배지(IL-2 및 IL-15 함유)에서 NK 세포를 재현탁합니다.
15. 96웰 U-바닥 플레이트에서 48시간 동안 2 ×^{10 6} NK cells/mL를 배양합니다.

2. DRG 뉴런 분리 및 배양

1. NK 세포 자극이 끝나기 24시간 전(단계 1.15)에 96웰 플레이트에 100μL/웰의 라미닌(1ng/mL)을 코팅하고 45분(37°C) 동안 배양합니다.
2. 배양 후 용액을 제거하고 웰을 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조시킵니다.
3. CO2 흡입을 사용하여 통각 수용기 뉴런을 그대로 안락사시킵니다(리터레이트 제어; TRPV1wt::D TAfl/wt) 또는 절제(TRPV1cre::D TAfl/wt) 마우스.
   참고: CO2 흡입은 DRG(배근 신경절)에 연결된 척추 신경을 방해하지 않기 때문에 경추 탈구보다 선호됩니다.
4. 엎드린 자세로 보드에 마우스를 고정하고 피부를 들어 올리고 등쪽 기둥을 따라 피부를 절개합니다.
5. 요추 관절을 잘라내고 가위로 요추에서 천골을 분리합니다.
6. 두개골 기저부에 도달할 때까지 척추 양쪽의 근육과 갈비뼈를 두개골 방향으로 절단하여 척추를 분리합니다.
7. 가위를 사용하여 대서양-후두 관절의 척추를 자릅니다.
8. 척추에서 근육과 지방 조직을 제거합니다.
9. 척추를 고정하고 열어 척수를 제거하고 DRG에 액세스할 수 있습니다. 등쪽 뿌리를 통해 척수에 연결되어 있지만 수막과 분리되어 있는 추간공(intervertebral foramina)에서 DRG를 찾습니다.
10. 10mL의 얼음처럼 차가운 DMEM으로 채워진 15mL 원뿔형 튜브에 DRG를 수확합니다.
11. 제제(200×g, 실온, 5분)를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
12. 콜라겐분해효소 IV(1mg/mL) 및 디스파아제 II(2.4U/mL)를 함유한 PBS 250μL를 추가합니다.
13. DRG를 Collagenase IV/Dispase II(C/D) 용액(80분, 37°C, 약한 교반)으로 배양합니다. 여러 마우스의 신경절을 풀링할 때, 신경절 당 125 μL의 C/D 용액의 비율을 유지하십시오.
14. 효소를 비활성화하려면 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지 5mL를 추가합니다.
15. 용액(200×g, 5분)을 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거합니다.
16. 원치 않는 세포 손실을 방지하려면 상층액을 ~100μL씩 남겨 두십시오.
17. 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다.
18. 피펫 건과 크기가 줄어드는 유리 파스퇴르 피펫 3개를 사용하여 DRG를 단일 세포 제제로 부드럽게 분쇄(파스퇴르 피펫 크기당 ~10 위/아래)합니다.
19. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 PBS(인산염 완충 식염수)에 소 혈청 알부민(BSA)을 최종 농도 15%로 희석합니다. 1mL 부분 표본을 -20°C에서 보관합니다.
20. 2mL의 멸균 PBS를 추가하고 튜브 바닥에 1mL의 15% BSA 용액을 천천히 분주하여 15mL 원뿔형 튜브에 BSA 그래디언트를 만듭니다. 피펫을 부드럽게 제거하여 그라데이션을 방해하지 마십시오.
21. P200 피펫을 사용하여 트리추에이트된 신경절 현탁액(뉴런을 포함)을 튜브 측면의 구배로 천천히 피펫팅합니다.
22. 뉴런 함유 BSA 구배(200 × g, 12분, 실온)를 원심분리합니다. 원심분리기의 가속 및 감속을 최소 속도로 설정합니다.
    참고: 원심분리 후 뉴런은 튜브 바닥에 있고 세포 파편은 BSA 구배에 갇히게 됩니다.
23. 피펫을 사용하여 모든 상층액을 부드럽게 제거합니다.
24. 500 μL의 Neurobasal에 세포를 재현탁합니다.
25. 플레이트 10 라미닌 코팅된 평평한 바닥 96웰 플레이트의 웰당⁴개의 뉴런(200μL의 neurobasal/well).
    참고: 평균적으로 조사자는 마우스당 ~8개의 웰을 채울 수 있습니다.
26. 부착을 허용하기 위하여 신경 세포 (37 °C, 밤새)를 배양하십시오.

3. 공동 문화

1. 뉴런 배양에서 neurobasal을 천천히 제거합니다.
2. IL-2 및 IL-15로 48시간 자극 후(단계 1.14-1.15 참조), NK 세포를 재현탁하고 10⁵ NK 세포/웰을 뉴런 배양(96웰 평면 바닥판)에 추가합니다.
   참고: 평균적으로 조사자는 마우스당 ~6개의 웰을 채울 수 있습니다.
3. 보충된 neurobasal MX(37°C, 48시간)에서 세포를 공동 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나-27	잭슨 연구소	고양이 번호: 009669
소 혈청 알부민(BSA) 배양 등급	세계적인 정밀 기기	고양이 번호: 504167
BV421 안티 마우스 NK-1.1	피셔 사이언티픽	고양이 번호: 12430112
셀 스트레이너(50μm)	피셔 사이언티픽	고양이 번호: A3160702
콜라겐분해효소 IV	피셔 사이언티픽	고양이 번호: 15140148
디스플레이 II	피셔 사이언티픽	고양이 번호: 13-678-20B
Dulbecco의 변형 독수리 매체(DMEM)	피셔 사이언티픽	고양이 번호: 07-200-95
EasySep 마우스 NK 세포 분리 키트	시그마	고양이 번호: CLS2595
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	시그마	고양이 번호: C0130
소 태아 혈청(FBS)	시그마	고양이 번호: 806552
유리 파스퇴르 피펫	시그마	카탈로그 번호: 470236-274
신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)	폭스바겐	카탈로그 번호: 02-0131
라미닌	시다레인	고양이 번호: 03-50/31
L-글루타민	지브코	카탈로그 번호: A14867-01
마우스 재조합 IL-15	지브코	카탈로그 번호: 22400-089
마우스 재조합 IL-2	지브코	카탈로그 번호: 21103-049
신경 성장 인자(NGF)	생명 기술	카탈로그 번호: 13257-019
신경기저 배지	페프로텍	고양이 번호: 450-51-10
페니실린과 스트렙토마이신	페프로텍	고양이 번호: 210-15
유봉	줄기세포 기술	카탈로그 번호: 19855
인산염 완충 식염수(PBS)	바이오레전드	고양이 번호: 108732	클론 PK136
RPMI 1640 미디어	바이오레전드	고양이 번호: 137606	클론 29A1.4
핀셋 및 해부 도구.	바이오레전드	카탈로그 번호: 65-0865-14
U자형 바닥 96웰 플레이트	바이오레전드	고양이 번호: 101319
생존 염료 eFlour-780	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)
CO2 인큐베이터
해부 현미경