1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

초록

출처: Er, S., et al. 1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시누클레인 축적 연구. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 마우스 배아의 중뇌에서 도파민 뉴런을 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 고립된 복부 중뇌 바닥은 효소를 사용하여 해리됩니다. 생성된 도파민 뉴런은 수확되어 다중 웰 플레이트 내부의 마이크로 섬으로 전달됩니다. 세포는 마이크로 아일랜드 내부의 고밀도로 세포를 유지하기 위해 도파민 뉴런 배지로 배양됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

1. 0.46% D-글루코스, 1% L-글루타민, 1% N2, 0.2% 프리모신으로 도파민 뉴런 배지(DPM)를 준비하고, Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12)로 완성합니다. 재료를 혼합한 후 DPM을 필터링합니다. DPM을 4°C에서 보관하고 각 부분 표본을 한 번만 데웁니다.
   메모: DPM은 도파민 뉴런에서 α-synuclein 축적을 감소시키므로 신경교세포주 유래 성장 인자(GDNF)를 포함해서는 안 됩니다.
2. 극도로 소수성인 실리콘화된 유리 피펫을 준비하여 배아 뉴런의 초기 처리 중에 표면에 대한 부착 및 세포 손실을 최소화합니다.
   1. 증류수 1L에 실리콘화 유체 10mL를 넣고 2L 용기에서 교반하여 혼합합니다. 유리 피펫을 실리콘화 용액에 15분 동안 담근 상태로 둡니다.
   2. 증류수로 피펫을 3-5회 헹굽니다. 피펫을 실온(RT)에서 밤새 건조하거나 100-120°C로 가열된 멸균 공간에서 1-2시간 동안 건조하여 건조 속도를 높입니다.
   3. 밀봉된 오토클레이브 백에 표준 오토클레이브로 피
   펫을 소독합니다.
3. 뉴런 파종에 사용할 96웰 플레이트의 중간 웰에 60μL의 PO 용액을 첨가하여 바닥이 투명한 폴리-L-오르니틴(PO) 코팅된 96웰 플레이트를 준비하고, 가장자리 효과를 피하기 위해 플레이트 가장자리에 웰의 최소 1열/열을 남겨둡니다. 코팅된 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 4시간 동안 유지하십시오.
4. 세포를 도금하기 전에 PO를 완전히 흡인하고 100μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척합니다. 웰에서 1x PBS를 흡입하고 완전한 건조를 위해 플레이트 뚜껑을 열어 둡니다.
   메모: 사용한 PO를 수집하고 필터링하여 재사용할 수 있습니다. 동일한 PO 솔루션에 대해 이 작업을 두 번 반복할 수 있습니다.
5. 이전에 코팅된 웰에 50μL의 DPM을 추가합니다. 100μL 플라스틱 팁으로 웰에서 DPM을 흡입하고 동시에 원을 그리며 웰 바닥을 긁어 각 웰 주변의 코팅을 제거합니다. PO 코팅된 섬은 우물 중앙에 남아 있습니다.
6. 층류 후드 아래에서 코팅된 각 아일랜드의 중간에 10μL의 DPM을 추가하여 마이크로 아일랜드를 만듭니다.
   메모: DPM으로 덮인 마이크로 아일랜드가 있는 플레이트는 세포를 분리하는 동안 1-2시간 동안 층류 후드 아래에 보관할 수 있습니다.

2. 배아 13.5일(E13.5) 마우스 배아로부터 복부 중뇌 기저부 분리

1. 해부하기 전에 10cm 페트리 접시에 Dulbecco의 완충액을 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
2. 기관의 지침에 따라 E13.5 임신한 암컷 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 등에 평평하게 놓고 앞쪽 몸체에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게로 자궁 위의 피부를 들어 올리고 수술 용 가위로 절개하여 자궁을 드러냅니다.
3. 조심스럽게 자궁을 제거하고 미리 준비한 얼음 위의 페트리 접시에 넣습니다.
4. RT에서 층판 후드 아래의 수술용 가위를 사용하여 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거합니다. 겸자로 배아에서 모든 태반 잔여물을 제거하고 Dulbecco의 완충액으로 채워진 새로운 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
5. 해부 집게나 바늘을 사용하여 그림 1A에서 검은색 화살표로 표시된 위치에서 머리의 뒷부분을 잘라냅니다. 절단된 조각을 배아의 나머지 부분에서 분리합니다(그림 1B).
6. 절단된 조각의 뒤쪽을 관찰자 쪽으로 놓고(그림 1C) 꼬리에서 두개골까지 부드럽게 잘라냅니다(그림 1D). 두개골 개구부 아래 0.5mm에서 그림 1E와 같이 2mm² –3mm² 영역을 자릅니다.
7. 빈 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 복부 중뇌 바닥(그림 1F 참조)을 수집합니다. 모든 중뇌 바닥이 모일 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 두십시오.
   메모: 또는 모든 배아 뇌를 해부한 후 1mL 마이크로피펫으로 중뇌 기저를 수집할 수 있습니다.

3. 96 웰 플레이트 형식의 E13.5 마우스 배아에서 1차 배아 중뇌 배양 확립

1. 동일한 1.5 mL 튜브에 모든 배아의 중뇌 기저를 채취한 후, 잔류 둘베코의 완충액을 제거하고 조직 조각을 500 μL의 Ca2⁺, Mg2⁺-free Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 세 번 세척합니다.
2. HBSS를 제거하고 튜브에 0.5% 트립신 500μL를 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 배양 중 1.5mL의 소 태아 혈청(FBS)을 37°C에서 가열하고 FBS에 30μL의 DNase I을 첨가한 후 혼합합니다. 또한 실리콘화된 유리 피펫의 끝을 불로 연마합니다. 구멍에 날카로운 모서리가 없고 1mL 마이크로피펫 팁과 거의 같은 크기인지 확인하십시오.
   메모: 대안으로, 낮은 접착력 1mL 마이크로피펫 팁을 분쇄에 사용할 수 있습니다. 그러나 실리콘 유리 피펫이 최상의 결과를 제공하는 것 같습니다.
4. 3.2단계의 배양이 끝나자마자 부분적으로 분해된 조직에 FBS/DNase 혼합물 500μL를 첨가합니다. 유리 피펫을 사용하여 FBS/트립신 혼합물의 조직을 분쇄합니다. 조직이 거의 보이지 않는 작은 입자로 해리될 때까지 삼중화합니다. trituration 동안 거품을 피하십시오.
5. 남은 입자가 중력에 의해 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 침전되도록 합니다. 바닥에 있는 침전물을 피펫팅하지 않고 상층액을 빈 15mL 원추형 폴리프로필렌 튜브에 모읍니다.
6. 3.3단계(98:2)의 FBS/DNase I을 1,000μL의 HBSS로 희석하여 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 얻습니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 1,000μL의 새 혼합물을 마이크로 원심분리기 튜브의 남은 입자에 추가합니다. 다시 트라이추얼하고 3.5단계를 반복합니다.
7. 이전 단계를 한 번 더 반복하여 모든 FBS/DNase-I/HBSS(49:1:50)를 모두 사용합니다.
8. 모든 상등액이 15mL 튜브 내부에 수집되면(3.5, 3.7 및 3.8 단계에서) 탁상용 원심분리기를 사용하여 100 x g에서 5분 동안 상층액(~3mL)을 회전시킵니다. 바닥의 펠릿화된 세포를 건드리지 않고 상층액을 제거합니다.
9. 튜브에 DPM 2mL를 추가하여 세포 펠릿을 세척하고 100 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 세척을 2회 반복하여 펠릿화된 세포의 파편을 최소화합니다.
   메모: 배양된 뉴런에는 항상 신선하고 따뜻한 DPM을 사용하십시오. 세척 단계의 경우 DPM이 신선할 필요는 없지만 37°C로 예열해야 합니다.
10. 신선하고 따뜻한 DPM으로 세포를 희석하고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 희석을 위한 DPM의 양은 조직 해부에 사용되는 배아의 수에 따라 다릅니다. 예를 들어, 150μL의 DPM을 사용하여 10개의 배아에서 얻은 세포를 희석합니다.
11. DPM에 있는 세포 10μL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10μL의 0.4% 트리판 블루 염색제와 혼합합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는(즉, Trypan blue 음성) 세포를 계수합니다.
    메모: 웰당 30,000개의 세포를 사용하여 웰당 ~1,000개의 도파민 뉴런을 얻습니다. 세포 밀도가 6 μL당 ~30,000 세포보다 높으면 파스딩 부피가 6 μL 이상이 되도록 도금하기 전에 DPM으로 세포를 더 희석합니다.
12. 웰의 바닥을 건드리지 않고 1.6단계에서 생성된 마이크로 아일랜드에서 DPM을 제거합니다.
13. 각 웰에서 재현 가능한 세포 밀도를 얻으려면 웰에서 도금하기 전에 부드러운 피펫팅으로 세포를 혼합합니다. 1–10 μL 마이크로피펫을 사용하여 6 μL의 세포를 웰 중앙, 이전의 각 마이크로 아일랜드 위치에 추가합니다.
14. 플레이트 가장자리의 빈 웰에 150μL의 물 또는 1x PBS를 채워 뉴런 배양이 포함된 웰의 증발을 최소화합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 1 시간 동안 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
15. 1시간 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포가 있는 각 웰에 100μL의 DPM을 추가한 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
16. 도금 2일 후(시험관 내 2일 또는 DIV2) 25μL를 제거하고 75μL의 새로운 DPM을 추가하여 최종 배지 부피를 150μL로 만들고 가능한 한 증발을 방지합니다.
17. DIV5에서 배지의 절반을 새 DPM으로 교환합니다(즉, 75μL를 제거하고 75μL의 새 DPM을 추가). DIV5 이후에는 미디어 변경을 수행하지 마십시오.

결과

그림 1: E13.5 마우스 배아의 중뇌 기저부 해부. (A) 머리 뒤쪽의 절단 위치는 검은색 화살표와 흰색 점선으로 표시됩니다. (B) 배아의 나머지 부분에서 조각을 제거했습니다. 제거된 조각은 원으로 표시됩니다. (C) 조각이 관찰자를 향하여 후방을 향하도록 90° 회전했습니다. (D) 조각은 꼬리에서 두개골까지 검은 화살표로 열렸습니다 (흰색 점선으로 표시). (E) 개구부 아래 0.5mm–1mm에서 2mm² –^4mm2 영역을 절단했습니다(검은색 선으로 표시). (F) 복부 중뇌 바닥이 고립되어 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4% 트리판 블루 스테인	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	15250061
15ml CELLSTAR 폴리프로필렌 튜브	Greiner Bio-One GmbH, 프리켄하우젠, 독일	188261
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	10236276001
5 M 염산	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
5M NaOH	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
96웰 뷰플레이트(블랙)	PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬	6005182
99.5% 에탄올(EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, 핀란드	해당 사항 없음
AquaSil 실리콘화 유체	Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	TS-42799
오토클레이브 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
Bioruptor 초음파 처리 장치	Diagenode, 리에주, 벨기에	B01020001
Ca2+, Mg2+ 무함유 행크스 균형 소금 용액(HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	제14175-053
CellProfiler 및 CellAnalyst 소프트웨어 패키지	해당 사항 없음	해당 사항 없음	무료 오픈 소스 소프트웨어
원심분리기 5702	Eppendorf AG, 함부르크, 독일	5702000019
CO2 인큐베이터	HeraCell, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	해당 사항 없음
계수 챔버	BioRad Inc., 미국 캘리포니아주 허큘리스	1450015
DeltaVision 초고해상도 현미경(에어 테이블 및 캐비닛 포함	GE Healthcare Life Sciences, 미국 매사추세츠주 보스턴	29254706
데옥시리보뉴클레아제-I(Dnase I)	Roche, Basel, 스위스	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	21331–020
둘베코의 버퍼	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
소 태아 세럼(FBS)	Gibco, Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	10500056
D-포도당	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	G8769 (영문
인산염 완충액 식염수(PBS)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소
프리모신	InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에이고.	개미-PM-1, 개미-오후-2
폴리-L-오르니틴	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	P4957
트리톤 X-100	시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스	11332481001
트립신	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, 중국	2199700

호 ) 년 )