초파리 유충 뇌 이식의 해부 및 장착

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 애벌레 뇌 이식 해부 및 장착

1. 생리학적 외부 식염수(120 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO₃, 10 mM 포도당, 10 mM 수크로오스, 5 mM N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산(TES), 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 2 mM Ca²⁺, pH 7.2)에서 두 쌍의 #5 표준 해부 겸자(11cm)가 있는 해부 현미경(4.5x 배율)으로 유충 뇌를 해부합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레 몸을 제자리에 고정하고 다른 한 쌍을 사용하여 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 안구 디스크, 뇌엽 및 복부 신경삭을 보존합니다. 이미징 중 샘플 움직임을 최소화하기 위해 부착된 근육을 제거합니다.
2. 유리 슬라이드 (25 x 75 x 1.0mm³)를 준비하고 주사기를 사용하여 진공 그리스로 사각형 챔버를 그립니다.
3. 그리스 장벽이 있는 사각 챔버에 20μL의 외부 식염수를 추가합니다.
4. 절개된 유충 뇌를 집게를 사용하여 유리 슬라이드의 챔버로 옮깁니다. 등쪽이 위를 향하도록 해부 범위 아래에서 뇌의 위치를 조정합니다.
5. 챔버를 유리 커버 슬립 (22 x 22 x 0.15 mm³)으로 덮으십시오. 유충 뇌는 이제 외부 식염수로 채워진 챔버 내의 슬라이드에 장착됩니다(그림 1B).
   메모: 커버슬립을 부드럽게 누르면 뇌가 제한되고 후속 이미징 세션에서 샘플이 표류하는 것을 줄일 수 있습니다.

그림 1: dendrite dynamics imaging 및 quantification 프로토콜의 워크플로우. (A) 프로토콜에는 샘플 준비, 이미지 수집, 이미지 처리 및 수상돌기 역학의 반자동 정량화를 포함하는 6단계가 포함되어 있습니다. (B) 등쪽이 위로 향하게 장착된 유충 뇌 이식을 포함하는 이미징 챔버를 보여주는 개략도. 뇌 이식은 각 엽에 개별적으로 라벨링된 복부 측면 뉴런(LNv)을 가지고 있으며 외부 식염수에 담그고 있습니다. 진공 그리스 장벽은 커버슬립의 무게를 지탱하고 뇌의 움직임을 막는 작은 챔버를 형성합니다.