유도 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화(Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells)

초록

출처: Phillips, A. W., et al. 생리학적으로 관련된 분석을 사용하여 3D 줄기 세포 배양 조사를 위한 HiPSC 유래 무혈청 배아체 개발. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 신경 전구 세포(NPC)로 구별하는 기술을 보여줍니다. 초기에 hiPSC는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 피더층(feeder layer)에서 배양됩니다. 그 후, 세포를 분리하여 생체 고분자로 코팅된 플레이트로 옮겨 MEF가 hiPSC에 부착되고 분리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 부유 hiPSC를 V-바닥 플레이트로 옮기고 원심분리하여 응집체를 형성합니다. 마지막으로, 분화 배지를 추가하면 응집체 내의 hiPSC가 NPC로 분화됩니다.

프로토콜

1. 신경전구세포의 생성

1. 섬유아세포 및 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 유래한 hiPSC를 소분자가 보충된 인간 iPSC 배지의 γ방사선 조사 마우스 배아 공급기(MEF) 세포층의 6웰 플레이트에서 유지합니다.
   참고: 일일 유지 관리는 이전에 보고된 절차의 수정된 버전입니다.
   1. 6 x 10⁵ MEF를 300μL/웰 권장 배지의 6웰 조직 배양 등급 플레이트의 각 웰에 플레이트(제조업체의 프로토콜에 따름).
   2. 48시간 후 hiPSC를 추가하기 전에 1시간 동안 MEF 배지를 300μL/well hiPSC 배지로 교체합니다.
   3. 37°C 수조에서 hiPSC를 빠르게 해동하고 1mL hiPSC 배지를 천천히 적가합니다. hiPSC와 배지를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 매체를 추가하여 총 부피를 5mL로 만듭니다. 129 x g에서 4분 동안 원심분리기를 진행하고, 상층액을 흡인하고, 1:1,000 농도의 Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제와 함께 1mL hiPSC 배지에 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
   4. MEF 세포층에 세포 현탁액(일반적으로 300,000 cells/well에서 seeding)을 플레이트화하고 37°C, 5% CO₂, 95% 습도에서 배양합니다.
   5. 광학 현미경을 사용하여 iPSC 배양을 면밀히 모니터링합니다. 48시간 후, 가장자리가 고르지 않거나, 낭포성 모양으로 자라거나, 광학 현미경에서 황갈색으로 보이는 배양물을 제거하여 자발적인 분화를 최소화합니다.
      메모: 7-10일 후에 hiPSC 집락이 형성됩니다. 군체는 둥글고, 명확하게 정의된 경계와 균일한 세포 밀도가 있어야 하며, 느슨하게 채워진 불균일한 세포가 없어야 합니다.
   6. 원형 hiPSC 콜로니를 수동으로 선택하여 자발적으로 분화된 세포의 배양을 제거합니다. 새로운 MEF 레이어에 배치하여 콜로니를 확장합니다. 문화가 합류 및 동결에 가까운 7일마다 1:3으로 확장됩니다.
2. 세포를 확장 및 동결한 후(백업용), 50 - 75% 합류점에 도달할 때까지 플레이트에서 hiPSC 콜로니를 성장시킵니다.
3. 도금 후 7일 후에 가벼운 효소 처리(300μL 효소 용액으로 5-10분) 및 부드러운 분쇄(1,000μL 피펫으로 2-4회)를 사용하여 신경 전구체 세포 분화를 위해 hiPSC를 수확하고 준비합니다.
4. 세포 현탁액을 129 x g에서 4분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 5mL human iPSC 배지에 재현탁합니다. MEF를 제거하고 hiPSC 수율을 최대화하기 위해 37°C에서 1시간 동안 0.1% 젤라틴으로 코팅된 5cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 옮깁니다. 배지(비부착성 세포 포함)를 다른 5cm 젤라틴 코팅 접시에 옮깁니다.
5. 전사 피펫을 사용하여 비부착성 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3mL 배지로 플레이트를 부드럽게 헹구고 15mL 튜브에 추가합니다.
6. 세포 현탁액을 129 x g에서 4분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 배지에서 부드럽게 재현탁합니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 확인합니다. 9,000 cells/well을 96-well 저접착 V-바닥 플레이트에 플레이트합니다.
7. 163 x g에서 3분 동안 플레이트를 원심분리하고 37°C, 습도 95% 및 5% CO₂에서 플레이트를 배양합니다. 피펫을 사용하여 배지의 절반을 제거하고 화학적으로 정의된 새로운 차별화 배지 1(DM1; 그림 1; 재료 표) 14일 동안.

결과

그림 1: SFEB 준비의 초기 단계를 개략적으로 보여주는 개략도. 효소 해리를 사용하여 iPSC를 수확한 후 96웰 플레이트에 도금하고 163 x g에서 3분 동안 원심분리하여 빠른 응집을 유도합니다. 14일 후 체외(DIV) 세포 응집체는 넓은 구멍의 피펫을 통해 96웰 플레이트에서 세포 배양 삽입물이 포함된 6웰 플레이트로 이동할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SFEB 신경 세포 분화 세포 배양 배지. 시약. 구성 요소
STEMdiff 신경 유도 매체(hiPSC 배지)	스템셀 테크놀로지스	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM 매체(MEF 매체)	글로벌스템	GSM-2001
DM1 미디어 구성 요소
D-MEM/F-12 (1X), 글루타맥스 액체, 1:1	인비트로젠	10565018	385ml
Knockout 세럼 교체	인비트로젠	10828028	20% 100ml
펜/연쇄상구균	인비트로젠	15140122	5 밀리람베르트
글루타맥스 200mM	인비트로젠	35050061	5 밀리람베르트
MEM 비필수 아미노산 용액 10mM(100X), 액체	인비트로젠	11140050	5 밀리람베르트
2-메르캅토에탄올(1,000X), 액상	인비트로젠	21985023	900ul
작은 분자
Y27632 (록키)	줄기 탐지기	04-0012-10	10미암수
부품/재료
마우스 배아 섬유아세포	글로벌스템	GSC-6301G
96 웰 V 바닥 w/뚜껑	상록	222-8031-01V
StemPro Accutase 세포 해리 시약	써모피셔	A1110501
6 잘 편평한 바닥	송골매	353046

년 년